副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因的合成及其克隆与鉴定

根据副溶血弧菌野生型菌株BB22 FlaI基因cDNA序列,通过合理的引物设计、链延伸反应、PCR反应以及分子克隆等技术,成功地合成出编码极鞭毛蛋白的FlaI基因全长片段,并将其克隆至pMD18-T载体质粒上.序列分析和酶切鉴定显示FlaI基因得到了正确的合成和克隆.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）。利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＥＸ。ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表     

Sry基因的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pCR3.1-Sry.并检验其在真核细胞内的表达.方法:用PCR法从小鼠基因组中扩增出Sty全长基因,重组入pMD18-T载体,酶切鉴定重组质粒,对酶切正确的重组质粒测序.双酶切测序验证的重组质粒.将切下的片段与真核表达质粒pCR3.1相连构建pCR3.1-Sty重组质粒.将其转染HeLa细胞后,RT-PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA的转录;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白质的表达.结果:PCR法扩增得到了1.2 kb的特异性Sry基因片段;成功地构建了真核表达重组质粒pCR3.1-Sry;重组质粒pCR3.1-Sry在HeLa细胞中mRNA及蛋白水平均可检测到表达.结论:重组质粒构建成功并可以在体外真核细胞中表达,为进一步研究其作为核酸疫茁的免疫作用提供了可控的实验材料.     

甘薯储藏蛋白(sporamin)A基因在大肠杆菌中的表达研究

利用基因重组技术,将ＰＣＲ扩增获得的甘薯储藏蛋白Ａ基因的成熟肽编码区序列,插入到高效表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＢ中,构建成重组表达质粒ｐＴＨＳＰＯ－Ａ,用限制酶切和ＰＣＲ分析均表明重组质粒与预期结果相符,用ＩＰＴＧ诱导重组质粒转化的大肠杆菌ＴＯＰ１０。菌体总蛋白经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一个大小为１０ｋＤ的蛋白质带,其分子量比预期值小。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

乙型肝炎表面抗原基因DNA介导的体液免疫初步研究

用ＣＰＲ技术从纯化的乙型肝炎病毒核酸中扩增出ｐｅｒＳ２－Ｓ基因,并将其定向克隆于真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中,构建成带有完整的乙肝表面前Ｓ２抗原基因和Ｓ基因的重组质粒。重组质粒经酶切及部分序列分析鉴定后,瞬时转梁小鼠Ｌ细胞,ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清液有ＨＢｓＡｇ表达。用纯化的重组质粒静脉、肌肉和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,首次接种质粒ＤＮＡ３周后,血清抗体开始出现,再次加强２周后,阳性     

副溶血弧菌VopS效应子基因的克隆与原核表达

副溶血弧菌可通过Ⅲ型分泌系统分泌效应毒力蛋白导致真核靶细胞的细胞溶解及细胞凋亡.VopS是Ⅲ型分泌系统中的一个效应毒力因子,能通过抑制NF-κB的活性介导巨噬细胞死亡.实验将效应因子VopS的编码基因克隆到pET28a(+)载体上,成功构建了pET28a(+)-vopS重组质粒,将该质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE分析,发现在分子量约为43 kDa处有一明显蛋白表达条带.用Ni2+-NTA柱亲和层析获得纯化蛋白,浓度为175 mg/L.为进一步研究副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统致病机制提供了材料.     

人源温和气单胞菌溶血素基因的克隆与表达

根据GenBank报道的人源温和气单胞菌溶血素(hly)基因序列设计引物,经PCR扩增,得到大小约为1470bp的阳性产物.利用BamHⅠ,HindⅢ位点将hly基因片段克隆到pMD19-T载体,构建得到重组质粒pWT-hly,并比较所克隆基因序列的同源性.然后将该基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pWET-hly,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE分析.结果表明:克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性为96.19%;重组菌株经IPTG诱导后,hly基因得到了高效表达.     

老年人生活空间移动性影响要素研究进展

 老年人生活空间移动性是老年人在日常生活中能动生活状态的重要表征。在梳理老年人生活空间移动性相关概念、测度方法基础上，分析了物质环境要素和非物质环境要素对老年人生活空间移动性的影响；提炼出有效支持老年人生活空间移动性的中观环境规划、微观环境设计和政策文化扶助层面的策略；指出了老年人生活空间移动性的研究建议和发展方向。     

发动机转动惯量的实验测定

发动机转动惯量是发动机系统动态模型的一个重要参数,一般需要通过试验测取发动机转速衰减曲线,再由曲线拟合而得。在文中提出一种试验曲线的全程拟合法,比以往的标定转速点拟合法可以取得更高的精度。     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

关于一维非自治时滞系统点态退化的例子

给出了一维非自治时滞系统点态退化的几个例子。     

辽阳职业技术学院高尔夫学院发展现状研究

采用问卷调查法、文献资料法、数理统计法对辽阳职业技术学院二级分院高尔夫学院成立三年来招生、专业设置、教师队伍与实习实训等现状进行深入调查与分析,结果表明:在招生方面,高尔夫学院目前还未能得到家长的充分认可,招生人数不多;专业设置单一,实践教学及社会服务能力薄弱;实习实训条件较好,但仍需进一步完善;教师队伍建设相对滞后.针对上述情况,给出促进高尔夫学院稳步发展的建议.     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

整数幂的和计算中的一些规律

给出整数幂的和的另一种计算公式的方法.     

膨胀土路基沉降的可靠度分析

针对膨胀土路基沉降的不稳定性和随机性等特点，以膨胀土的膨胀率、线收缩系数、初始含水量、工后沉降期始末的孔隙比变化量和固结度变化量、工后沉降期末的含水量等为基本变量，提出了膨胀土路基沉降的可靠度分析方法和可靠度指标的迭代计算步骤，并就具体工程实例进行了膨胀土路基沉降可靠度计算．结果表明按强度和稳定性设计原则设计的路基的工后沉降超过容许沉降的失效概率较大。     

接受美学的期待之路——读者接受与文学的创新

文学发展的动力之一在于创新。在接受美学诞生之前,学者们往往从作家的角度讨论文学创新问题。本文用接受美学的理论探讨文学创新的问题。笔者将文学创新的标准与读者接受相结合,就创新的三个方式与期待视野的方法论进行了初步的探讨。最后得出的结论是:读者期待视野的提高是作家作品创新的主要依据,作家在文学创作中应该充分考虑读者的接受才能做到创新。     

曲面“侧”概念的“参照物”理解法

曲面“侧”是一个重要而难以理解的概念 ,本文对曲面“侧”概念的讲授方法进行了探讨 ,给出了曲面“侧”概念的“参照物”理解法 ,通过实践证明 ,效果良好。