在单细胞水平建立原位PCR基因鉴别技术平台——以精子基因型鉴别为例

目的精子发生是一个包括有丝分裂和减数分裂的精细调控过程,这一过程是从精原干细胞开始在雄性睾丸的曲细精管中完成的,由哺乳动物雌雄性比例接近1∶1这一现象可以推知:受精时带X基因的精子和带Y基因的精子比率应该是1∶1,但事实上精子发生的过程中,分化出来的X、Y精子的比例是否也为1∶1并不清楚,因为精子发生过程中并不是所有细胞都能最终形成精子,然而要研究雌雄出生比率就需要先研究精子本身是否严格地按照1∶1形成,因此本实验通过建立快速可靠原位PCR技术平台为进一步研究精子发生的调控过程提供支持。步骤用HSL基因优化荧光原位PCR实验方案,包括蛋白酶K作用时间和浓度,原位PCR前先对精子进行解聚,再用SRY基因对精子进行原位PCR鉴定。结果在荧光显微镜下可清楚地看到精子头部的荧光信号,头部有绿色荧光信号的精子为带有SRY基因的Y染色体精子(Y精子),实验检测到昆明小鼠精子共493个,有信号的共273个,X∶Y=55.37%,经卡方检验,X精子与Y精子的实验结果趋近于1∶1。结论可利用荧光原位PCR技术在单细胞水平快速鉴定精子"性别",理论上可用于任何细胞的任何基因的鉴定。     

人体解剖生理学实验教学改革探究

人体解剖生理学实验的传统教学多以验证性实验为主,往往忽视各实验间的联系,且缺乏综合性和设计性实验项目.本课题在前期教学基础上,整合了实验教学内容、重构了实验教学体系.将人体解剖生理学实验分设为基础性实验、综合性实验和设计性实验三部分.通过该项目的实施,不仅提高了教学效率,而且也激发了学生的学习热情,同时也提高了学生的创新和探索能力.     

激素敏感脂酶(HSL)基因敲除小鼠认知行为的研究

目的:评估HSL基因敲除小鼠的学习记忆功能.方法:采用经典的Morris水迷宫实验,测试三种基因型小鼠的认知行为变化.结果:三种基因型小鼠的潜伏期几乎都逐渐缩短,雄性正常小鼠的潜伏期在1～2天,明显地短于HSL敲除小鼠(P<0.01);雌性正常小鼠的潜伏期在第3～5天,明显地短于HSL敲除小鼠(P<0.01),随后几天都无显著差异.第8天撤去平台,小鼠跨越原平台位置的次数无显著差异.结论:HSL敲除的小鼠都存在明显的认知水平功能障碍,雄性小鼠在前期差异显著,雌性小鼠在中期差异显著,但给予适当的学习训练后都能达到正常小鼠的认知水平.     

BAY及DMSO在体外对小鼠精子顶体反应的影响

目的探究BAY(激素敏感脂酶抑制剂)及DMSO(二甲基亚砜)对小鼠精子顶体反应(AR)的直接影响。方法分别通过5个和6个不同的浓度梯度的BAY及DMSO在体外探究其对小鼠精子AR的影响,在不同孵育时间段采用FITC-PSA和考马斯亮蓝染色法对小鼠精子的顶体反应进行鉴定。结果在所选浓度范围内BAY未能直接影响精子的顶体反应及存活率(P>0.05),而DMSO在一定浓度和时间内可直接影响精子顶体反应及精子存活率。结论 DMSO和BAY对小鼠精子发生的作用是通过不同途径来实现的,前者可直接影响精子顶体反应和精子的存活率,而后者则与顶体反应及存活率无关。提示在AR的研究中使用DMSO时需控制好作用浓度及作用时间。     

Sry基因的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pCR3.1-Sry.并检验其在真核细胞内的表达.方法:用PCR法从小鼠基因组中扩增出Sty全长基因,重组入pMD18-T载体,酶切鉴定重组质粒,对酶切正确的重组质粒测序.双酶切测序验证的重组质粒.将切下的片段与真核表达质粒pCR3.1相连构建pCR3.1-Sty重组质粒.将其转染HeLa细胞后,RT-PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA的转录;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白质的表达.结果:PCR法扩增得到了1.2 kb的特异性Sry基因片段;成功地构建了真核表达重组质粒pCR3.1-Sry;重组质粒pCR3.1-Sry在HeLa细胞中mRNA及蛋白水平均可检测到表达.结论:重组质粒构建成功并可以在体外真核细胞中表达,为进一步研究其作为核酸疫茁的免疫作用提供了可控的实验材料.     

壬基酚或双酚A对原代培养鲫肝细胞毒性的影响

以纯化的鲫（Carassius auratus）肝细胞为试验对象,研究不同浓度壬基酚（NP）或双酚A（BPA）对肝细胞增殖、乳酸脱氢酶（LDH）释放,丙二醛（MDA）含量,谷胱甘肽-s转移酶（GST）,7-乙氧异吩噁唑酮-O-脱乙基酶（EROD）活性的影响.结果表明,鲫肝细胞暴露于不同浓度的NP或BPA 24 h后,随着NP、BPA浓度的升高,细胞增殖率明显降低（P〈0.05）;肝细胞LDH的渗出量、MDA、GST及EROD活性均显著增加（P〈0.05）.表明,NP或BPA对鲫肝细胞增具有一定的毒性作用.而且BPA对肝细胞的毒害作用要弱于NP（P〈0.05）.