乙醇对南美白对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与构象的影响

以南美白对虾为材料,分离提纯N 乙酰 β D 氨基葡萄糖苷酶,研究乙醇对该酶的活力与构象影响.结果表明,浓度低于22%(体积比)的乙醇对该酶活力有明显的激活效应;乙醇浓度为8%时,达到最大激活效应,酶活力为纯酶的180%.动力学研究表明,在30%浓度范围内,乙醇对酶活性的激活及抑制作用均是可逆的.乙醇低浓度下,Km值与Vmax值随乙醇浓度增大而增大;随着乙醇浓度的进一步升高,Km值保持不变,Vmax值则出现下降.紫外光谱与荧光光谱分析表明,低浓度乙醇对N 乙酰 β D 氨基葡萄糖苷酶的构象产生轻微的影响,而高浓度乙醇则使酶的整体构象趋于松散.由此可以推断,乙醇对该酶的活力影响是微扰酶活性中心产生激活效应与引发整体变构失活效应的共同作用结果.     

尼罗罗非鱼肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质分析

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是生物体内主要的溶酶体水解酶之一,广泛存在于动植物和微生物体内.以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏作为材料,采用硫酸铵(饱和度30%～70%)分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、Sephadex G-200分子筛凝胶过滤柱层析的方法分离纯化NAGase,得到比活力为2 988U/mg的酶制剂.经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测呈现单一条带,说明所得酶为PAGE单一纯.通过Sephadex G-200柱层析法测得NAGase的总分子质量为61.8ku,结合SDS-PAGE结果,说明该酶仅有一个亚基.进一步测定了NAGase的酶学性质:NAGase水解底物对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)的最适温度为55℃,温度稳定范围为0～55℃,超过75℃时则完全丧失活性;NAGase水解底物的最适pH为5.8,pH稳定范围为4.0～9.0,pH大于9.0时几乎完全失活;该酶水解底物的动力学参数Km和vm分别为0.229mmol/L和9.346μmol/(L·min);运用化学修饰法分析发现二硫键、氨基、组氨酸咪唑基和色氨酸吲哚基均是NAGase的活性必需基团,而精氨酸胍基则不是其活性必需基团.     

苦瓜过氧化物酶的提取分离及性质测定

从苦瓜(Momordica charantia L.)中分离和纯化过氧化物酶(POD),分别测定其最适pH值、最适温度、热稳定性、底物浓度对酶活性的影响。结果表明:苦瓜过氧化物酶以邻苯二胺为底物时λmax=425nm,Km=4.6×10-3,Vmax=0.137unit/s,最适pH值为4.6,最适温度是50℃。在温度为50℃时过氧化物酶的酶活力最大,酶活性较高。在温度为60℃以上时过氧化物酶的失活率升高,在温度为70℃以上时过氧化物酶基本失活。抗坏血酸和半胱胺酸对过氧化物酶有明显的抑制作用,其失活率分别达到94%和92%;Al3 的抑制作用稍弱,过氧化物酶的失活率为69%;EDTA的抑制效果最不明显,过氧化物酶的失活率仅为13%。     

白孢链霉菌(Streptomyces albosporeus)CT—86几丁质酶研究

应用磷酸膨胀几丁质双层平板,从土壤中篩选到48株分解几丁质的链霉菌。经紫外线诱变后,得到一株能强烈分解磷酸膨胀几丁质的突变株CT—86。在1～1.5％的磷酸膨胀几丁质、1％豆饼粉的营养盐培养基中,30℃培养8～10天,酶活达到0.4mg N—乙酰葡萄胺/h。在几丁质浓废为0.5～1％范围内,单位酶活随几丁质浓度的增加而提高。以葡萄糖和N—乙酰葡萄糖胺为碳源时,在上述培养条件下,无酶活捡出。磷酸膨胀几丁质为底物,酶作用的最适温度是48℃,最适pH为6.5;酶液在60℃保温2小时后,酶活力丧失70％左右。     

嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3蛋白酶基因的原核表达、纯化和性质表征

将来源于嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的蛋白酶(PH1704)基因在大肠杆菌BLP-CodonPlus中高效表达.采用超声、热失活和HiTrap Q Sepharose柱层析等方法对产物进行分离纯化.通过SDS-PAGE,Native-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,发现该重组酶以十二聚体为主的寡聚体形式存在,并具有SDS抗性.蛋白酶活力染色表明,其六聚体以上有活力.以azo-gelation为底物,对其酶学性质进行初步研究表明,其最适温度为85℃,最适pH=8.0,并且具有良好的热稳定性.     

产琼脂糖酶海洋微生物的筛选鉴定及酶学性质研究

从红藻中筛选获得一株能产生明显液化现象并具有较高琼脂糖酶活力的菌株Ag-1,经生理生化实验和16S r DNA序列分析鉴定为弧菌属(Vibrio sp.).酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为50℃,40~50℃水浴保温1 h可保持68%以上的酶活力;最适反应p H值为8.0,在p H 7.0~8.0保温1 h可保持90%以上的酶活力,在p H 8.0~9.0保温1 h仍可保持70%以上的酶活力,具有较好的耐热性和耐碱性;且该酶对琼脂底物具有高度专一性;K+、Ca2+、Mg2+、Li+和Fe3+对琼脂糖酶活力具有激活作用,Mn2+、Zn2+和Cu2+对琼脂糖酶具有抑制作用.酶反应动力学实验结果表明,该酶的最适底物浓度为8 mg·m L-1,动力学参数Km为0.58 mg·m L-1,vmax为3.29 U·mg-1.     

锯缘青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活动力学研究

研究甲醛对锯缘青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase EC 3．2．1．52）活力的影响．结果表明：随着甲醛浓度的增大．酶活力呈指数下降．导致酶活力下降50％的甲醛浓度（失活半衰期，IC50）为0．60mol／L。酶在低浓度甲醛溶液中的失活过程显示为可逆失活．用底物反应动力学方法考察酶在甲醛溶液中的失活动力学．测定游离酶（E）和酶-底物络合物（ES）在甲醛溶液中失活的微观速度常数。并比较游离酶（E）和酶-底物络合物（ES）的正向反应的微观失活速度常数k＋0〉k’＋0．表明底物对酶被甲醛的失活作用有一定的保护作用．正向的失活速度常数k＋0和k’＋0随着甲醛浓度的增大而增大．而逆向的速度常数k-0随着甲醛浓度的增大而减小．表明随着甲醛浓度的增大。酶变性越来越快。而活力恢复越来越难．     

链霉菌M1033葡萄糖异构酶的分离纯化及其性质的研究

链霉菌M1033菌株所产的葡萄糖异构酶培养液经二级(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE-Sephadex A50,Sephadex-G150柱层析分离纯化,可得到电泳均一的纯酶。该酶的全分子量为91000左右,由两个相同的亚基组成。其pI为4.3,经糖染色后证明并非糖蛋白;最适反应温度70℃,在该温度下分别以D-木糖和D-葡萄糖为底物,测得最适pH分别为8.0和8.3。该酶为金属激活酶。Co~(2 )和Mg~(2 )对该酶有激活作用,Ca~(2 )则使之几乎失活。金属离子的激活作用随底物而异。动力学研究表明,该酶对D-木糖有更大的亲和性。     

青霉葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究

从青霉(Penicillium amagasakiense)发酵液中分离纯化葡萄糖氧化酶(简称GOD),通过DEAE-32离子交换柱层析、Sephacryl S-200分子筛凝胶过滤柱层析纯化,获得比活力为472 U/mg电泳单一纯酶制剂,采用SDS-PAGE电泳,表明该酶含有两个同型的亚基,分子量为150 ku.酶学性质研究表明:该酶催化葡萄糖氧化酶反应的最适pH为5.6,最适温度为40℃.酶的热稳定性研究表明:该酶在pH 5.5～8.5区间和温度低于50℃下稳定.金属离子对酶活力的影响表明:Na+、K+、Ca2+、Pb2+、Mn2+等对酶活力基本没有影响;Al3+、Zn2+对酶有一定的激活作用;Ag+、Hg2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+、Co2+等对该酶活力有不同程度的抑制作用.该酶以葡萄糖为底物的米氏常数Km值为122.6 mmol/L,Vm为25.52 μmol/(L·min)(pH 7.0,37℃).     

蝾螺β-葡萄糖苷酶性质的初步研究

以海洋蝾螺(TurboPetholatusLinnaeus)内脏为原料,经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵沉淀初步抽提,再经DEAE cellulose(DE 32)、SephadexG 200等柱层析纯化,获得较纯的β 葡萄糖苷酶.本文对β 葡萄糖苷酶的基本性质进行初步研究,结果表明:β 葡萄糖苷酶催化底物pNP G水解的最适pH及最适温度分别为pH5.5和45℃.β 葡萄糖苷酶在pH为4.5～6.5之间稳定.温度30℃以上则逐渐失活.其反应Km为0.076mmol/L(37℃).活化能Ea为15.4kJ/mol.金属离子对酶的作用表明,Cu2 ,Hg2 ,Pb2 有强烈的抑制作用,Fe3 ,Cd2 ,Zn2 浓度小于1.0mmol/L时,抑制较弱,但在浓度大于1.0mmol/L时,抑制明显;Mn2 ,Ca2 在低浓度下对酶活力无明显影响,但在高浓度条件下有较强抑制作用,Mg2 略有激活效应.     

钝顶螺旋藻Fe-SOD的纯化及性质

以螺旋藻中分离纯化的Fe-SOD平均比活为4576U/mg，总活力回收率50%，纯度达电泳纯，SDS-PAGE测定纯化的Fe-SOD亚基相对分子质量为21ku，每分子亚基含0.7个Fe原子；在Tris-盐到缓冲液中的最适pH为8.2，最适温度为25℃，在紫外区279nm有最大光吸收，酶的pH稳定范围为6～11，65℃以上迅速的失活，该酶对H2O2敏感，在5mmol/L H2O2中迅速失活，而在Ψ=0.1的乙腈和5mmol/L叠氮化钠中稳定。     

榨菜中多酚氧化酶特性的研究

为探讨榨菜的保鲜及防褐变技术,对榨菜中多酚氧化酶的研究表明,榨菜中多酚氧化酶以邻苯二酚为底物时,产物最大吸收波长是420 nm,酶的最适pH为7.4,最适反应温度为53℃,Km为0.181 9 mol.L-1.该酶在85℃时仍有较强热稳定性,L-半胱氨酸盐酸盐对该酶活性有很强的抑制作用.     

家蚕碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质

经10％～50％硫酸铵分级沉淀分离，DEAE—Sepharose离子交换柱层析,Sephacryl S-200凝胶过滤纯化,从家蚕（Bombyx mori）肠液中分离纯化出电泳纯的碱性磷酸酶、该酶提纯倍数为464倍，比活力为3936U／mg、酶学性质和动力学性质研究表明，该酶催化磷酸苯二钠的水解反应，最适pH值为10.5，pH小于7.5和大于11均不稳定；最适温度为40℃，温度高于50℃不稳定；米氏常数Km值为1．25mmo1／L.     

刺槐幼苗中L-亮氨酸氨基转移酶的提纯和特性

<正>刺槐幼苗中的L-亮氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.6,LAT)经热处理、硫酸铵沉淀、Sephadex G-100和DEAE-纤维素柱层析被提纯61倍,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一的带。这种酶的分子量为7×10~4,最适pH为9.0,最适温度为60℃,它对L-亮氨酸的km为2.5mM,对α-酮戊二酸的km为3.5mM;全酶的吸收光谱在230和280nm显示两个主峰,在320和425nm显示两个小峰,透析后320和425nm的小峰基本消失;这种脱辅基酶蛋白无活力,但与100μM磷酸吡哆醛保温1～4h便可恢复活力80～100％,这表示刺槐LAT的辅基是磷酸吡哆醛;一些羰基试剂和底物类似物(二羧酸)能抑制这种酶的活力,除Co~(2+)外,Mg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对酶活力都无抑制,1×10~(-4)MHg~(2+)和1×10~(-3)M金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)对酶无抑制作用暗示,刺槐LAT没有对活力所需要的硫氢基和金属离子。     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

丙酮对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与构象的影响

以丙酮为效应物,研究其对锯缘青蟹(Scylla serrata)N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果表明:该酶的剩余活力随着丙酮浓度增大而呈指数下降,当丙酮浓度达25%,酶的剩余活力仅为20%,说明丙酮对青蟹NA-Gase有明显的失活作用.导致酶活力丧失50%的丙酮浓度为7.5%.在较低丙酮浓度(＜10%)的失活是可逆的反应过程.动力学研究表明,该酶的失活过程属于混合型,并进一步测定游离酶(E)和酶底物络合物(ES)与丙酮的结合常数(K1和K1s),分别为4.06%和10.49%,K1＜K1s,说明底物存在对酶被丙酮的失活作用有一定的保护作用.应用荧光发射光谱研究青蟹NAGase经丙酮微扰后的分子构象变化情况,结果表明:丙酮对酶分子构象有显著的影响,酶的内源荧光强度随丙酮浓度增大而降低,说明酶分子中的生色基团Trp和Tyr残基的微环境发生了变化.     

青霉素酰化酶研究——Ⅰ.抑制作用,纯化和性质

丙酮、乙醇和苯丙氨酸是大肠杆菌青霉素酰化酶的竞争性抑制剂,分别抑制模拟底物3-苯乙酰胺基6-硝基苯甲酸水解的活力。青霉素酰化酶粗酶液经硫酸铵盐析,pH5沉淀,SE-Sephadex C50层析,苯丙氨酸-Sepharose 4B疏水层析和DEAE-Sephadex A25层析可得纯酶,聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳呈现一条带,比活为27.5u/mg蛋白。纯化总活力回收率为28.1%。青霉素酰化酶分子量约为90000,有两个亚基,分子量分别为70000和20000,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,催化青霉素G水解的米氏常数为2.94mmol/L。     

木质素降解真菌粗毛栓菌(Trametes gallica)蓝色漆酶的分离纯化及性质研究

作者对粗毛栓菌(Trametesgallica)在PAG培养基条件下摇瓶培养产生漆酶的情况进行了研究.15d左右达到产酶高峰,随后进入平台期.对15d产生的漆酶进行分离纯化.4L发酵液经硫酸铵沉淀,DEAE SepharoseFastFlow柱层析和SephadexG 100柱层析,漆酶被纯化了36.9倍.经SDS PAGE验证为一条带,表观分子量约为60,000Da.纯化漆酶是一种含糖量6%的糖蛋白,且在605nm处具有蓝色漆酶Ⅰ型铜离子典型的吸收峰.以ABTS,DMP和愈创木酚为底物,反应的最适pH值分别为2.2,3.0和4.0;Km值分别为0.172×10-2,0.51,0.48mmol/L.以ABTS为底物,最适反应温度为70℃.在pH7～9处理24h,纯化漆酶仍保持较高活性.EDTA,卤素离子,NaCN和NaN3对酶活有抑制作用,其中NaN3是最强的抑制剂.纯化的蓝色漆酶不具有氨酸酶活性,但能够氧化非传统底物酚红.     

菊芋多酚氧化酶的酶学性质

为了解菊芋提取物氧化变色的机理,用分光光度法分别研究了以邻苯二酚为底物的酶促褐变反应动力学和pH值、温度、底物浓度、酶浓度对该反应的影响,以及不同底物对多酚氧化酶活性的影响,揭示了菊芋多酚氧化酶(PPO)的基本酶学性质.结果表明:菊芋PPO催化邻苯二酚氧化反应的最适pH值为4.8,最适温度为35℃;菊芋PPO的热稳定性差,85℃以上加热处理5min就可使其大部分失活;菊芋PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程所描述的规律,相应的动力学参数Km=0.013 mol/L,Vmax=7.5 mmol/s.菊芋PPO的活性随酶浓度的增加而增大,酶的添加量超过0.8mL后,增速逐步减小;菊芋多酚氧化酶对邻位多酚的氧化具有专一性.     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的纯化及其性质的研究

大肠杆菌菌体经机械研磨,硫酸铵分级,sephadex G-100层析,再用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到电泳均一的 L-谷氨酸脱羧酶纯品.酶作用的最适pH 为4.4,在 pH3.6～5.8稳定;最适温度50℃,50℃以下稳定;于60℃保温30min,酶活力保留65%.此酶作用于 L-谷氨酸的 K_m 值为1.39×10~(-2)mol/L,金属离子 Zn~(2+),Cu~(2+),Mg~(2+),Fe~(2+)分别不同程度的抑制此酶,EDTA 无抑制作用.该酶在280nm 处有最大光吸收,与蛋白质在280nm 处有最大光吸收值的普遍性质相一致.