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N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是生物体内主要的溶酶体水解酶之一,广泛存在于动植物和微生物体内.以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏作为材料,采用硫酸铵(饱和度30%～70%)分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、Sephadex G-200分子筛凝胶过滤柱层析的方法分离纯化NAGase,得到比活力为2 988U/mg的酶制剂.经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测呈现单一条带,说明所得酶为PAGE单一纯.通过Sephadex G-200柱层析法测得NAGase的总分子质量为61.8ku,结合SDS-PAGE结果,说明该酶仅有一个亚基.进一步测定了NAGase的酶学性质:NAGase水解底物对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)的最适温度为55℃,温度稳定范围为0～55℃,超过75℃时则完全丧失活性;NAGase水解底物的最适pH为5.8,pH稳定范围为4.0～9.0,pH大于9.0时几乎完全失活;该酶水解底物的动力学参数Km和vm分别为0.229mmol/L和9.346μmol/(L·min);运用化学修饰法分析发现二硫键、氨基、组氨酸咪唑基和色氨酸吲哚基均是NAGase的活性必需基团,而精氨酸胍基则不是其活性必需基团. 相似文献
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