表达vWF蛋白的重组BHK细胞的无血清培养

采用HADAMARD统计设计方法建立了适于重组BHK细胞培养和vWF蛋白表达的无血清培养基SFMA。用SFMA进行重组BHK细胞的批培养,细胞生长明显优于有血清培养(DMEM FBS(φPRS=0．05))和无血清培养基SFM-Ⅱ的培养,最大细胞密度可分别提高16．7％和40%。同时,在培养的96h,蛋白的表达水平比有血清培养提高了18．7%,SFMA维持培养48h的vWF蛋白的表达水平比SFM-Ⅱ提高了50％。     

基因改造AiiA蛋白在毕赤酵母中的表达

基于毕赤酵母基因组偏好密码子数据表对编码Aii A蛋白的碱基序列进行密码子优化,并构建多拷贝重组Oaii A表达载体p PICZαB-x Oaii A(x=1,2,3),成功表达出具有活性的Aii A蛋白.实验结果表明,优化后Oaii A基因的表达量(2.64 mg·L-1)较优化前aii A的表达量(1.38 mg·L-1)提高约两倍.优化后二拷贝和三拷贝表达量分别为2.84 mg·L-1和2.93 mg·L-1.结果表明密码子优化可以有效提高Aii A蛋白在毕赤酵母中的表达,但是多拷贝表达载体对Aii A的表达促进作用并不显著.提示未来在探索Aii A蛋白在毕赤酵母中的高表达时,通过增加拷贝数来提高产量并不是一个很好的途径,而进行密码子的优化可以有效提高产量.     

ELPs-PDOR融合基因表达条件的优化

利用均匀设计法和二次多项式逐步回归,对重组大肠杆菌生产类弹性蛋白多肽-1,3-丙二醇氧化还原酶(ELPs-PDOR)重组蛋白的培养条件进行优化.结果表明:在装液量为30%,诱导剂浓度为6.3mmol·L-1,诱导温度为30℃,诱导时间为2h的优化条件下进行培养,重组菌融合蛋白表达量是原始表达量的3.3倍,酶活力提高到10.84mkat·L-1,提高2.1倍.     

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的串联表达

根据Gen Bank中猪表皮生长因子(p EGF)基因信息设计引物,通过PCR、亚克隆、基因重组等技术,构建得到p EGF拷贝数分别为1、2、3的原核重组表达质粒.用重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,在37℃诱导条件下,1、2、3拷贝p EGF重组质粒均能表达p EGF蛋白,灰度值分析表明:表达的融合蛋白占菌体蛋白总量分别为9.54%、20.37%、26.79%,表明在原核表达中,对p EGF进行同向串联,增加其拷贝数,可以提高p EGF在表达后融合蛋白中所占比例,相应提高p EGF蛋白产量.本研究为p EGF重组蛋白的高效表达和批量生产提供可靠的依据.     

结核分枝杆菌RipB基因的克隆、表达及对藤黄微球菌生长的影响

提取肺结核分枝杆菌基因组DNA,PCR扩增RipB基因并将其连接到表达载体pET-21a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白.SDSPAGE表明:重组RipB表达蛋白量约占菌体总蛋白量的40％,而其在37℃表达时主要为包涵体,在15℃表达时主要在可溶上清内;Ni柱一步亲和层析获得重组RipB;100 pmol/L重组RipB可显著促进藤黄微球菌生长.     

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.     

温度对重组BHK细胞生长、代谢和vWF蛋白表达的影响

通过重组幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)在不同温度下的批培养和脉冲培养,研究了温度对重组BHK细胞生长、代谢以及血管性血友病因子(vWF)蛋白表达的影响。相对于37℃,升高和降低温度的培养都降低了细胞的生长速率和密度,降温的作用更明显,主要表现为延长了细胞生长的迟滞期。在不同温度的脉冲培养中,细胞的比生长速率变化不大,表明进入对数生长期后,细胞生长对一定范围的温度变化不敏感。培养温度对细胞群体中处于S期的细胞比例影响不大,但在33℃和39℃下培养,细胞群体中处于G0/G1期的细胞比例有明显升高,处于G2/M期的细胞比例下降。当培养温度降低到33℃时,细胞群体中发生凋亡的细胞数随着温度升高而增加。温度的降低能显著提高单个细胞的vWF蛋白表达能力,在33℃下培养,vWF平均比生产速率提高了45%。     

不同温度培养对香菇漆酶活性及转录表达的影响

以香菇新808为材料,研究不同温度培养下漆酶活性及其基因表达调控特征.通过平板培养法测定4种温度(20℃、25℃、28℃和30℃)对香菇菌丝圈及氧化圈的影响,通过液体发酵测定漆酶活性,并采用qPCR技术检测漆酶同工酶基因的相对表达量.结果表明:不同温度条件下,漆酶的活性及转录表达存在明显差异.25℃培养条件下香菇菌丝圈及氧化圈最大,漆酶活性最强(114.11 U/mL);而30℃时的菌丝圈和氧化圈最小,漆酶活性低(47.52 U/mL).不同温度培养下漆酶同工酶基因出现差异性表达,以25℃为对照组,20℃培养条件下9个漆酶基因(Llac1-3、Llac5和Llac7-11)表达量上调,28℃处理下除Llac5和Llac7基因以外,其余8个漆酶基因表达量发生上调,而30℃处理组6个漆酶基因(Llac1-2、Llac4、Llac7-8和Llac10)表达量下调.表明20℃处理下有助于漆酶基因的表达,而30℃处理下则抑制了其同工酶基因的表达.     

抗CPAα毒素单链抗体基因的克隆和表达及其生物学特性研究

应用RT—PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌 (CPA)α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其定向克隆于表达载体 pHOG2 1中 ,构建重组表达载体 pHOG 2E3,转化至大肠杆菌XL1 Blue中 ,筛选出表达菌株XL1 Blue(pHOG 2E3)。SDS PAGE分析结果表明 ,在 2 0℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %,ScFv蛋白主要以包涵体的形式存在 ,但在胞周质和培养上清中也能检测到ScFv蛋白 ,其中在胞周质中表达的ScFv蛋白占菌体可溶性蛋白的 4 %。生物学试验结果表明 ,ScFv基因表达产物不仅能够中和α毒素的磷酯酶C活性 ,而且对攻击致死剂量α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

优化合成有机磷水解酶opd p基因在毕赤酵母中的表达

拟验证通过密码子优化有机磷水解酶(opd)基因,和生物砖方法构建opd多拷贝载体,以提高在毕赤酵母中的表达量.将原始的opd基因依照毕赤酵母偏爱密码子设计合成新的有机磷水解酶基因,并在C端添加了6个His-Tag融合蛋白标签.所合成的opd p基因全长1 149 bp(base pair).基因克隆入p HBM905BDM毕赤酵母表达型质粒,成功构建重组表达质粒p HBM905BDM-opd p,以及多拷贝表达质粒p HBM905BDM-opd p-2C,p HBM905BDM-opd p-3C,p HBM905BDMopd p-4C,转化毕赤酵母感受态细胞GS115.实验结果表明,经甲醇诱导后,在AOX1(乙醇氧化酶基因)启动子调控下,获得OPD P蛋白分泌表达,Western Blot检测4个转化的菌株中都表达了目的蛋白,且两拷贝表达量较一拷贝有提高,达到0.2 U/m L.但是随着拷贝数的进一步增加表达量呈现下降的趋势.     

流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性

建立了流式细胞仪检测重组巴斯德毕赤酵母(P.p astoris)细胞活性的方法,并在高密度发酵过程中得到应用。使用碘化丙锭染色法测定细胞活性,发现甲醇诱导时酵母细胞活性开始下降,随着细胞密度的增加,由于细胞胁迫和甲醇的影响,细胞活性明显下降,活细胞率最大下降了14%。与此同时,细胞生长减缓,目的蛋白发生降解,表明细胞活性与发酵过程中细胞的生长和目的蛋白生成等参数密切相关。实验证明:流式细胞仪可作为检测毕赤酵母发酵过程中细胞活性参数的一个便捷精确的有力工具。     

Expression and Characterization of HGV E2 cDNA in Pichia pastoris

A 559 base pair fragment of cDNA locating at the putative E2 region of GBV-C/HGV was in-serted into Pichia pastoris expression vector pPICgK in the reading frame of α-factor secreting signal pep-tide. The recombinant expression plasmid pPIC9K-E2 was introduced into P. pastoris GSll5 with electro-poration and recombined with the host genome by homological recombination. The His+Mut+ recombinantyeasts were selected and cultivated in the BMMY medium. After 3 days induction with 0. 5% methanol,the target protein(E2) accumulated up to 30% of total proteins in the supernatant. The expressed E2 pro-tein was proved possessing antigenicity and high specificity with Western blot and ELISA probed with serafrom the immunized rabbits and the patients infected by GBV-C/HGV.     

红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达．利用PCR技术从YEpFLAG-1-DsRFP扩增出DsRFP编码序列．克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3．5K构建重组表达载体pPIC3．5K-DsRFP．电击转化进毕赤酵母．G418-RDB平板双重筛选后获得重组转化子．经MM／MD平板培养与PCR鉴定．重组子全部为HIS^ -MUT^ 表型．重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达．摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12％．表达量达到1．8g／L．经硫酸铵分级沉淀，DE-AE-5PW阴离子交换柱层析与S-HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白．说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力。     

Expression and characterization of HGV E2 cDNA inPichia pastoris

A 559 base pair fragment of cDNA locating at the putative E2 region of GBV-C/HGV was inserted intoPichia pastoris expression vector pPIC9K in the reading frame of α-factor secreting signal peptide. The recombinant expression plasmid pPIC9K-E2 was introduced intoP. pastoris GS 115 with electroporation and recombined with the host genome by homological recombination. The His⁺Mut⁺ recombinant yeasts were selected and cultivated in the BMMY medium. After 3 days induction with 0.5% methanol, the target protein (E2) accumulated up to 30% of total proteins in the supernatant. The expressed E2 protein was proved possessing antigenicity and high specificity with Western blot and ELISA probed with sera from the immunized rabbits and the patients infected by GBV-C/HGV. Biography: Wang Zhuo-hua (1977-), female, Master, research direction: genetic engineering pharmaceuticals.     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

毕赤酵母YPS1基因的失活对减少重组人血清白蛋白降解的作用

重组人血清白蛋白在毕赤酵母系统的分泌表达产物除了完整的重组人血清白蛋白外,还存在一约45 ku大小的主要降解片段,直接影响了重组人血清白蛋白的产量和后续的纯化研究.为了减少重组人血清白蛋白的降解,采用同源重组的方法,使毕赤酵母中蛋白酶基因YPS1失活,构建获得蛋白酶缺陷型菌株,研究YPS1基因失活后对重组人血清白蛋白降解的影响.结果表明,毕赤酵母YPS1基因的失活有效地减少了重组人血清白蛋白的降解,完整的重组人血清白蛋白在总蛋白中的比例由原来的60%提高到88%,降解片段由原先的40%降低到10%左右.     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

酿酒酵母呼吸突变株的高糖胁迫反应研究

【目的】研究野生型甘蔗糖蜜发酵高产乙醇菌株MF1002及其糖分利用能力显著提高的呼吸突变菌株MF15c在高糖胁迫下的生理特性变化。【方法】测定在高糖胁迫下菌株的生长速率、出芽率、乙醇产量和超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力。【结果】在葡萄糖浓度分别为25%、30%和40%的高糖培养基中,MF15c菌株生长和乙醇发酵受抑制的程度均明显低于MF1002。当葡萄糖浓度为30%和40%时,MF15c的最大菌体数目、最高出芽率和乙醇发酵浓度等均显著高于MF1002。当葡萄糖浓度为30%时,两菌株胞内的SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力均显著上升。其中,MF15c的胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力在高糖胁迫下的上升幅度显著高于MF1002。【结论】MF15c较MF1002具有更强的高糖耐受能力。SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶均参与了两菌株的高糖胁迫反应,胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力可能与MF15c菌株的高糖耐受能力有关,可作为进一步改造该菌株的指导指标。     

小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达

实验利用已构建的分泌型重组表达质粒pPIC9-mmLEAP-2,氯化锂转化表达宿主菌GS115毕赤酵母;应用表型和PCR技术筛选高拷贝转化株。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS—PAGE分析重组mmLEAP-2表达量,为进一步研究mmLEAP-2的活性奠定了基础。