重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制

在利用转基因毕赤酵母发酵表达重组人血清白蛋白时,遇到了较为严重的蛋白降解;为了抑制蛋白的降解,分别研究了温度、pH值和氮源的加入对降解的影响。结果表明,pH值和氮源的加入对白蛋白的降解控制有显著的正面影响,而温度的变化对降解的影响不大。当控制pH为7.0,添加酵母提取物和蛋白胨体积分数分别为0.5%和1%时,白蛋白的降解得到了有效的控制,可得到质量分数为58%的完整白蛋白。     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

HIV-1外膜蛋白gp120在酵母Pichia pastoris中的表达

目的 用巴斯德毕赤酵母系统表达HIV外膜糖蛋白gp120.方法 将从HIV-1型国际标准株pHXB2-gp160的基因序列中扩增出的gp 120分子的长片段基因(1 419 bp)和短片段基因(417bp)分别克隆入真核表达载体pPICZαA与pPICZB中,以电穿孔法转化酵母GS 115.用YPDS-zeo平板筛选重组子、PCR方法检测整合到酵母菌GS 115基因组中的gp 120片段基因,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.结果 诱导后gp 120短片段多肽在GS 115中少量表达,在诱导表达24 h重组蛋白表达量及抗原性达到最高,表达产物被降解,具有良好的抗原特异性.诱导后gp 120长片段多肽未被GS 115所表达.结论 在巴斯德毕赤酵母中成功表达gp 120分子长片段需要优化gp 120基因,为制备HIV-1的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础.     

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg~(-1),5 L发酵液上清酶活为909U·mg~(-1).发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg~(-1),并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.     

肿瘤抑制因子p53蛋白在毕赤酵母中的克隆表达

TP53基因在调控细胞信号通路和抑制肿瘤细胞中发挥着重要作用.本研究利用毕赤酵母表达系统以获得大量重组p53蛋白,为此,本文将人TP53基因克隆至表达载体p PIC3.5K,电转化进入毕赤酵母GS115,通过组氨酸筛选和G418筛选,获得高拷贝稳定转化子.SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明p53蛋白可以在毕赤酵母中表达.本研究所获酵母菌株为今后大规模生产重组p53蛋白奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

将编码枯草芽孢杆菌AS1.398 的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中,电转化His4 缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168,通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,枯草芽孢杆菌AS1.398的全长中性蛋白酶基因在毕赤酵母中获得了高效表达,表达产物分泌至培养基中,分子量约为43kD。经甲醇诱导培养后,发酵液中的中性蛋白酶活力达20000 U/mL。     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

不同载体-宿主菌组合对重组蛋白表达量的影响

研究了不同载体-宿主菌组合对毕赤酵母重组蛋白表达量的影响。以豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)与ONC的融合蛋白即HSA-(Gly_4Ser_1)_3-ONC(简称HSA-ONC)等5种重组蛋白为报告蛋白,设计并合成了5种基因。分别插入3种酵母表达载体p PIC9、p PIC9K和p PICZα-A中,转化3种毕赤酵母受体菌X-33、GS115和SMD1168。筛选得到7种载体-宿主菌组合,在摇瓶规模进行诱导并定量。研究结果表明:5种外源蛋白在p PICZα-A/X-33组合中表达量最高,在p PIC9/SMD1168组合中最低。从重组蛋白表达量来说,p PICZα-A/X-33组合优于其他6种载体-宿主菌组合。     

重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象

研究了pH和温度对重组毕赤酵母表达retep lase(rPA)发酵过程中的降解现象。在低pH(4.5)诱导条件下,由于蛋白酶活性高,rPA降解严重,表达量几乎为0,提高诱导pH至6.5,蛋白酶活性降低,rPA的表达量最高达到122 m g/L。通过将诱导温度从30°C降低到20°C,rPA的表达量从153.2 m g/L提高到207.9 m g/L。降低温度能减少细胞死亡率,从而减少了发酵液中蛋白酶的释放,降低了蛋白酶的活性,抑制了对目的蛋白rPA的降解。另外,低温使胞内AOX酶活性提高,从而增强了rPA的表达。     

重组毕赤酵母体系生成PlUGT1蛋白适宜条件研究

通过单因素试验分别研究pH值和温度对重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1生长以及甲醇浓度、pH值和温度对诱导表达PlUGT1蛋白的影响.结果表明,pH6.5和30 ℃是培养重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1最佳的生长条件,重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1诱导表达蛋白的适宜条件为甲醇体积分数0.5%、30 ℃和pH5.0,该条件下培养72 h,培养液中的蛋白质量浓度为0.721mg/mL.     

毕赤酵母表达硒代重组人血清白蛋白的研究

本试验将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后，流加亚硒酸钠，同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠)，通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量，判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后，进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析。结果表明，加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%，硒与蛋白质的质量比为0.0069，高于对照发酵液近35倍，初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化，转化为硒代氨基酸，并形成硒代重组蛋白质。     

在毕赤酵母菌中表达的hGlp-1-白蛋白融合蛋白的纯化

为了延长胰高血糖素样肽-1(GLP-1)在血浆中的半衰期,实验构建了编码GLP-1和白蛋白的融合蛋白基因,并在毕赤酵母中获得高效表达.发酵液经超滤后,分别采用了阴阳离子交换法和染料亲和法进行纯化.结果表明,用染料亲合法纯化能够有效地去除发酵过程中产生的弱酸性绿色化合物.经电泳鉴定纯度可达到95%,回收率可达到60%.     

3-酮基嘌呤还原酶(TSC10)表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的：Tsc10基因所编码的3-酮基嘌呤还原酶是酵母中神经酰胺合成的重要因子,本文研究从酵母中提取神经酰胺经济、便捷、高效的方法。方法：1.利用构建含有tsc10基因的毕赤酵母GS115表达载体pPIC3.5K-tsc10。2.电转化法将该表达质粒转化到GS115感受态细胞中。3.用G418筛选以及PCR鉴定。4.使用qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测。结果：经过G418筛选以及PCR鉴定后确定获得了包含tsc10基因的毕赤酵母转化子,经过qRT-PCR和SDS-PAGE进行检测后发现tsc10基因在20个阳性菌株中均可以稳定、高效表达。结论：本方法成功构建了3-酮基嘌呤还原酶高表达的毕赤酵母菌株,并为后续获得高收率神经酰胺奠定了基础。     

人白介素—12（P40）亚基在巴斯德毕赤酵母中的表达

运用PCR技术特异性地扩增了IL－12p40亚基cDNA的编码区序列,得到940bp的扩增片段,将其克隆于毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαC的ClαⅠ,XbaⅠ位点,构建成重组表达质粒pPICZαC-p40。经LiCI2转化,Zeocin抗性筛选,得到含多拷贝p40基因的酵母工程菌Pichia pastoris X-33/p40,在φ=0.5%甲醇诱导下,p40基因得到了分泌型表达,培养上清的SDS－PAGE及Westem-blot均显示表达产物相对分子质量约44000,与预计大小相符,薄层凝胶扫描结果表明,分泌型表达占培养上清总蛋白量质量的47％。     

重组毕氏酵母发酵过程的结构模型

分析了毕氏酵母（Pichia pastoris)以甘油和甲醇为碳源时的代谢途径，建立了胞内物质流和能量流的平衡方程－结构模型。经过适当的降维，解得比碳源消耗速率，比氧消耗速率，比乙酰辅酶A生成速率，细胞比生长速率等关键反应速率。结合反应器模型获得操作变量与过程状态变量间的关系。用实验数据对模型进行了初步验证。结果表明，该模型能较准确地描述细胞生长和重组蛋白合成过程。     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。     

黑曲霉外切葡聚糖酶基因密码子的优化及表达

通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)对黑曲霉的来源外切葡聚糖酶基因(cbh1)的氨基酸序列进行分析,发现其16个活性部位中有6个位点附近的氨基酸为毕赤酵母(Pichia pasto-ris)表达的稀有密码子。利用反向长距离PCR技术将这些活性位点附近的稀有密码子定点突变为毕赤酵母表达偏爱密码子。将优化后的表达载体pPICZαA-cbh1m转入毕赤酵母KM71H菌株中进行诱导表达。经密码子优化后的cbh1m基因较未优化前cbh1基因的表达量提高了17%。