耐热α-淀粉酶的筛选、基因克隆和酶学性质分析

【目的】筛选耐热α-淀粉酶并实现异源表达,同时分析其酶学性质特征。【方法】以M9培养基加上可溶性淀粉作为选择性分离培养基,从腾冲火山温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-3。根据淀粉酶氨基酸保守序列,设计引物进行PCR扩增,然后对目标序列进行步移扩增,获得淀粉酶基因AmyGX。将AmyGX与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】AmyGX基因长1 515 bp,编码505个氨基酸残基,前23个氨基酸残基为信号肽序列;重组质粒pQE30-AmyGX编码的蛋白分子量为58.04kDa,对可溶性淀粉催化水解反应的最适温度为60℃,最适pH值为8.0,V_(max)、K_m值分别为0.19U/mg、3.14mg/mL,热半失活温度T_(50)~(30)值为65.2℃;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)对该酶具有明显的抑制作用,Na~+、K~+对该酶有激活作用,Mg~(2+)、Ca~(2+)的影响则不明显。【结论】AmyGX是一种中等耐温碱性酶,在造纸、洗涤剂生产和有毒废弃物去除等方面具有潜在的应用前景。     

低温淀粉酶菌株分离及其酶学性质研究

通过淀粉底物平板从南极土壤中分离筛选出一株产淀粉酶的菌株,通过16S rDNA鉴定为氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)菌株.酶学性质表征发现该酶的最适温度为20℃,最适pH为9.0.摇瓶发酵2 d,酶的比酶活为15.7 U/mg.Ca~(2+)和Mg~(2+)对其有激活作用,而Hg~(2+)和Ni~(2+)是该酶的强力抑制剂.同时,该酶不但可以水解直链淀粉,还可以水解支链淀粉,表现出较宽泛的底物选择性.以上结果表明Arthrobacter oxydans产生的淀粉酶符合低温淀粉酶的特性,在食品上有一定的应用前景.     

芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

库拉索芦荟叶皮经匀浆、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose fast flow层析和Superdex-200prep grade层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,BGL).纯化结果是β-葡萄糖苷酶比活力为98.48U/mg,纯化倍数为328.27倍,酶活性回收率为9.87%,全酶分子质量约为69.3kD,亚基分子质量约为69.7kD.酶学性质研究表明:β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和5.0;在20~30℃及pH4.0~8.0范围内稳定性较好;最适条件下,以pNPG为底物的K_m值为2.21mmol/L,V_(max)为1.381μmol/(min·L).乙醇,抗坏血酸,Mn~(2+),K~+对该酶活性具有激活作用;SDS,Cu~(2+)对该酶活性具有强烈抑制作用;异丙醇,EDTA,尿素,Mg~(2+),Li+对该酶活性影响较小;甲醇对该酶有双重作用.     

极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

选择来源于极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis(DSM12029)的普鲁兰酶基因,以购自德国菌种保藏中心的基因组为模板,扩增出普鲁兰酶基因TM-pulA;利用酶切酶连构建了重组质粒pET21a-TM-pulA;转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达并经纯化后,进行了水解产物分析和酶学性质测定.结果显示:TM-pulA为Ⅰ型普鲁兰酶,最适pH为5.8;最适温度是80℃;70℃下半衰期为4.75 h;Mn~(2+)、Co~(2+)、AL~(3+)、Fe~(3+)、SDS及EDTA对其酶活有不同程度的抑制作用;该酶的K_m、V_(max)、K_(cat)及K_(cat)/Km值分别为4.68 g·L~(-1)、0.0085 mmol·L~(-1)·s~(-1)、71.18 s~(-1)、15.21 L·g~(-1)·s~(-1).     

产琼脂糖酶海洋微生物的筛选鉴定及酶学性质研究

从红藻中筛选获得一株能产生明显液化现象并具有较高琼脂糖酶活力的菌株Ag-1,经生理生化实验和16S r DNA序列分析鉴定为弧菌属(Vibrio sp.).酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为50℃,40~50℃水浴保温1 h可保持68%以上的酶活力;最适反应p H值为8.0,在p H 7.0~8.0保温1 h可保持90%以上的酶活力,在p H 8.0~9.0保温1 h仍可保持70%以上的酶活力,具有较好的耐热性和耐碱性;且该酶对琼脂底物具有高度专一性;K+、Ca2+、Mg2+、Li+和Fe3+对琼脂糖酶活力具有激活作用,Mn2+、Zn2+和Cu2+对琼脂糖酶具有抑制作用.酶反应动力学实验结果表明,该酶的最适底物浓度为8 mg·m L-1,动力学参数Km为0.58 mg·m L-1,vmax为3.29 U·mg-1.     

结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定

从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40. 06 k D.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,表明两者均仅具有羧甲基纤维素钠活性,纤维素酶EGT和EG的最适反应温度分别为45℃和55℃,EGT更加耐高温.最适pH均为7. 0,都具有较好的pH稳定性.Mn~(2+)、Fe~(2+)对两者具有激活作用,Zn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、NH_4~(2+)和Mn~(2+)对其都具有抑制作用.EGT的K_m=3. 09 mg/mL,比酶活为98. 4 U/mg; EG的K_m=8. 654 mg/mL,比酶活为53. 53 U/mg. EGT结合区的部分缺失导致酶与底物的亲和能力更好,同时比酶活提高183%,水解能力更强.     

宏基因组来源β-半乳糖苷酶的异源表达与酶学性质研究

β-半乳糖苷酶在食品行业具有重要应用价值,开发兼具多种优良特性的β-半乳糖苷酶是目前研究的重点.本研究对胃肠道微生物宏基因组来源的β-半乳糖苷酶基因galRBM1进行异源表达、纯化及酶学性质研究,结果表明,重组β-半乳糖苷酶的最适pH为7.0,最适温度为50℃,30~50℃耐受4h仍保持85%以上剩余酶活;pH稳定性较好,pH5~10范围内耐受1h仍保持80%以上的相对酶活.Fe~(2+)和Fe~(3+)对该酶酶活有强烈促进作用,Cu~(2+)、Ag~+和Tween-80则表现出不同程度的抑制.该酶耐盐性较好,0~30%NaCl条件下耐受1h相对酶活仍剩余40%以上.     

麻疯树过氧化氢酶的分离纯化

麻疯树种仁经抽提、硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B层析、DEAE-Sepharose F.F.层析,获得了纯化的麻疯树过氧化氢酶(CAT).该酶比活力为69.23 U/mg,纯化倍数为37.63倍.经Sephacryl S-300 HR测定,该酶表观分子量为232 kD,SDS-PAGE显示为一条分子量为59 kD的条带,表明该酶是由四个相同的分子量为59 kD的亚基组成.经等电聚焦测定该酶的等电点为4.7.经过温度和pH考察,该酶最适温度为30℃,最适pH为7.0.Mn~(2+)对酶活有促进作用,Zn~(2+)、Cd~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Co~(2+)有抑制作用.6×10~(-3)mmol/L NaN_3以及0.9 mmol/L KCN能使酶活丧失.该酶的V_(max)和K_m分别为5 U/mL·min,1.5 mmol/L.     

两个苹果酸酶的表达和酶学性质分析

为了探讨深黄被孢霉M6-22中不同苹果酸酶的性质,研究从深黄被孢霉M6-22中克隆得到苹果酸酶MIME1基因并在大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和NADPH,具有苹果酸酶的特性.同时与前期获得的MIME2进行酶学性质分析.结果显示,重组表达的MIME1和MIME2都具有苹果酸酶的性质,但MIME1的最适温度和最适pH分别为28℃和7.5,MIME2的最适温度和最适pH分别为30℃和5.8,而且在最适温度和最适pH条件下所纯化的MIME1和MIME2酶活分别为292.84 U/mg和235.14 U/mg.进一步酶学性质分析表明,Mg~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn ~(2+)可以提高MIME1的活性,其中Cu~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Ca~(2+)、Mn~(2+)对MIME1的活性则有抑制作用;Mn~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)和Ca~(2+)对MIME2表现出不同程度的激活作用,其中Mn~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Cu~(2+)和Zn~(2+)则对MIME2的酶活表现出明显的抑制作用.这些分析结果表明,同一种细胞中不同的苹果酸酶具有不同的酶学性质,这可能与它们执行不同的生物学功能有关.通过异源表达和分离纯化,研究初步揭示了2个深黄被孢霉M6-22苹果酸酶的一些酶学性质特点,这为以后深入研究该苹果酸酶结构和功能以及与M6-22菌株油脂积累的关系提供了理论依据和参考.     

假单胞菌HS-D36偏苯三酚1,2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究

由pnpC编码的偏苯三酚1,2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase,PnpC)是微生物分解硝基芳香族类环境污染物的关键酶.本研究从对硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)降解菌HSD38(Pseudomonas sp.)中克隆pnpC基因,利用E.coli BL21(DE3)高效表达重组PnpC,通过亲和色谱纯化并分析其催化特性.实验结果表明:HS-D36的pnpC开放阅读框长度为873bp,编码290个氨基酸,酶蛋白相对分子量33KD;20℃、异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导可高效表达重组PnpC;重组酶经Ni-NTA亲和色谱一步分离可达到电泳纯;纯酶比活力9.3U/mg,纯化倍数37.2,活力收率23.8%;重组PnpC催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃、最适pH 5.0;Lineweaver-Burk双倒数作图表明PnpC对邻苯二酚降解的米氏常数(Km)为21.95mol/L、最大反应速度(Vmax)为2.68mol/(min·mg);Fe3+、Cu2+、Fe2+和Zn2+对该酶具激活作用,Ni 2+则显示抑制效应.     

青霉葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究

从青霉(Penicillium amagasakiense)发酵液中分离纯化葡萄糖氧化酶(简称GOD),通过DEAE-32离子交换柱层析、Sephacryl S-200分子筛凝胶过滤柱层析纯化,获得比活力为472 U/mg电泳单一纯酶制剂,采用SDS-PAGE电泳,表明该酶含有两个同型的亚基,分子量为150 ku.酶学性质研究表明:该酶催化葡萄糖氧化酶反应的最适pH为5.6,最适温度为40℃.酶的热稳定性研究表明:该酶在pH 5.5～8.5区间和温度低于50℃下稳定.金属离子对酶活力的影响表明:Na+、K+、Ca2+、Pb2+、Mn2+等对酶活力基本没有影响;Al3+、Zn2+对酶有一定的激活作用;Ag+、Hg2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+、Co2+等对该酶活力有不同程度的抑制作用.该酶以葡萄糖为底物的米氏常数Km值为122.6 mmol/L,Vm为25.52 μmol/(L·min)(pH 7.0,37℃).     

海洋贝类肠道弧菌21Z1碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质

由威海海域贝类肠道中分离出一株产胞外碱性蛋白酶的细菌,经16S rDNA分析鉴定为弧菌21Z1。该菌发酵液上清经60%饱和度的硫酸铵溶液沉淀、透析、Sephadex-G100分子筛层析等步骤,获得电泳纯的21Z1碱性蛋白酶,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示其分子量约为31 kDa。酶学性质测定结果显示:该酶最适反应温度为40℃,在20~40℃稳定;最适反应pH为8.5,在pH=8.5~11.0间稳定;Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有激活作用,Fe~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)及Cu~(2+)则不同程度地抑制其活性;该酶的耐盐性检测结果显示,在Na~+浓度为4 mol/L时,残余酶活在62%以上,表明21Z1碱性蛋白酶具有较强的耐盐性。     

重组草酸青霉生淀粉糖化酶的酶学特性鉴定

【目的】了解在毕赤酵母中表达的来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)GXU20的重组生淀粉糖化酶的酶学特性。【方法】用3,5-二硝基水杨酸法测定pH值、温度、金属离子和化学试剂对纯化的重组生淀粉糖化酶的活力的影响,同时测定酶的底物特异性、酶对生淀粉的吸附能力以及酶对不同生淀粉的水解效率等,用高效液相色谱法对该酶水解生木薯淀粉的产物进行分析鉴定,用扫描电子显微镜观察重组酶对不同生淀粉颗粒的水解方式。【结果】重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的最适pH值为4.5,最适温度为65℃,在pH值为2.0~10.0时,重组酶具有较好的pH耐受性,温度小于50℃时,酶的稳定性好。除Ag~+、Cu~(2+)和SDS之外,其他大部分金属离子和化学试剂对重组酶的酶活力影响不大。重组生淀粉糖化酶对大米和玉米生淀粉的活性较高,对木薯和马铃薯生淀粉的活性次之,重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同生淀粉的吸附能力与其对相应不同生淀粉的水解活性大小呈正相关。扫描电子显微镜观察表明重组生淀粉糖化酶对不同生淀粉颗粒的降解作用明显,水解方式各有特点。高效液相色谱分析表明该重组生淀粉糖化酶水解生木薯淀粉的产物仅有葡萄糖。重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在40℃下对大米和玉米生淀粉水解72h后水解率分别达到86.5%和71.9%。【结论】重组生淀粉糖化酶具有广泛的pH耐受性,对生淀粉具有高水解活性,在生淀粉的水解和生料同步糖化发酵生产酒精中有一定的应用潜力。     

产生淀粉糖化酶菌株的分离以及酶性质的初步研究

从霉变物、土壤、醋曲、醋醅等分离出四株产生淀粉糖化酶且酶活较高的菌株,选取酶活最高的菌株vin-1作为出发菌株,初步鉴定为Aspergillus niger,其生淀粉糖化酶活力达到342U/g(干曲),酶最适作用温度为55℃,酶在pH值3．5～4．5之间有较高的酶活,最适pH值为4．0,Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有一定的激活作用,而Fe~(2+)、K~+、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)都有较强的抑制作用,Mn~(2+)抑制作用最大,达到近50%。     

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

短乳杆菌来源重组β-半乳糖苷酶初步分离纯化与酶学特性研究

将实验室克隆得到的E. coli BL21/pET28a-bga B-18重组菌株在IPTG的诱导下进行表达,对其表达的β-半乳糖苷酶性质进行研究.首先,通过离心收取重组菌菌体;其次,通过超声破碎菌体细胞,再用镍柱对重组蛋白质进行亲和层析;最后,收集层析液,再利用紫外分光光度计测定重组β-半乳糖苷酶活性,并研究其酶学性质.结果表明:该酶的最适反应温度为37℃,最适pH值为7.5;在温度30～50℃、pH 6.0～8.0范围内酶稳定性较好; Mg~(2+)、Mn~(2+)为其激活剂,Cu~(2+)为其抑制剂;测得K_m=0.816 mmol/L,V_(max)=45.87 mmol/(L·min).     

球孢白僵菌017壳聚糖酶的研究I酶制剂的基本特征

球孢白僵菌017突变菌株(Beauveria bassiana 017)在CTN培养基(含0.2～1％壳聚糖,0.075％KH_2PO_4,0.05％MgSO_4,0.05％NaCl,0.001％FeSO_4,0.3％KNO_3,0,1％牛肉膏,pH5.0)中,20～30℃,200r·p·m振荡培养7天,可以分泌大量的胞外壳聚糖酶,对底物水解的最适温度为45～50℃,最适pH值为3.8～4.0。K_m值和V_(max)分别为2.17×10~(-6)M和0.45μmol/min,60℃保温1小时,剩余酶活性为10％,Ca~(2+),Mn~(2+)和Mg~(2+)对酶有激活作用,Cu~(2+)和Fe~(3+)对酶有部分抑制作用,Hg~(2+)和Ag~+则强烈抑制酶的活性。     

一种新型有机磷降解酶的二异丙基氟磷酸酯水解特性研究

有机磷降解酶是降解有机磷化合物(包括神经毒剂)的一类重要酶.本实验室克隆了铜绿假单胞菌HS-D38的有机磷降解酶基因opd(organophosphate degradation),并经定点突变与原核表达获得了一种新型重组有机磷降解酶OPD.本文研究了该重组有机磷降解酶OPD的分离纯化,及其降解有机磷神经毒剂模拟剂二异丙基氟磷酸酯(diisopropyl fluorophosphate,DFP)的性质.研究结果表明,重组有机磷水解酶OPD经Ni-NTA亲和色谱纯化后,比活力达到了218U/mg.该酶的最适温度为35℃,最适pH为8.0;金属离子Zn2+、Cr2+、Co2+对酶活性有激活作用.重组有机磷水解酶OPD对DFP的Km为1.05mmol.L-1,Vm为0.218mmol.L-1.min-1.     

玉米半胱氨酸蛋白酶的原核表达及酶学性质表征

以玉米基因组DNA为模板扩增获得玉米半胱氨酸蛋白酶基因(zmCP1),先将其克隆至pET-28a(+)原核表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.对重组酶进行诱导表达后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,经Ni柱纯化后其质量分数大于95%.利用二肽荧光底物(R-AMC)和四肽荧光底物(LAFR-AMC)进行酶反应动力学实验,证明该酶对小底物R-AMC具有更好的亲和力和催化活性.重组酶的酶学性质研究表明,该酶最适温度为55℃,最适pH值为6.0,在90℃下的半衰期为39.82min.     

假单胞菌593多铜氧化酶CopA的漆酶活性研究

从假单胞菌593中克隆出多铜氧化酶copA基因,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3) p Lys S过量表达和纯化.纯化的CopA蛋白展示出漆酶活性,针对漆酶的3种底物ABTS、DMP、SGZ,CopA的最适反应pH分别是3. 5、7. 5和7. 5,最适反应温度分别是50℃、50℃和42℃.pH稳定性和热稳定研究发现,在pH 7. 0条件下,CopA比较稳定,在温度大于42℃保存该蛋白,其活性降低较快.二价金属离子影响实验发现,CopA漆酶活性能被二价铜离子显著加强.酶动力学常数实验结果展示,CopA作用于底物ABTS,K_m为0. 281 mmol/L,V_(max)为3. 02×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为1. 8 s~(-1); CopA作用于底物DMP,K_m为0. 141 mmol/L,V_(max)为4. 54×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为2. 2 s~(-1); CopA作用于底物SGZ,K_m为0. 025 mmol/L,V_(max)等于0. 7×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为0. 87 s~(-1).