枯草芽孢杆菌高效转化及其转化子验证方法

用构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600感受态细胞,进行不同时间预培养后,涂布于抗生素平板培养,研究一种更高效的转化方法。用载体与外源片段的连接产物转化WB600感受态细胞,进行最佳预培养时间培养后,涂布于抗生素平板培养,培养得到的转化子用PCR快速验证和双酶切鉴定,研究一种转化子的快速验证方法。     

绿桐增殖、生根培养及炼苗移栽研究

本研究旨在建立适于绿桐（Paulownia fortunei×Paulownia tomentosa）的快速无性繁殖技术,为试管苗工厂化生产提供技术参考。实验以绿桐当年生枝条为外植体,对消毒方式、取材部位、植物生长调节剂及其浓度配比条件进行优化,筛选合适的诱导、增殖和生根培养基。实验结果表明,最佳消毒方式为依次采用75%乙醇、等体积的10%次氯酸钠与0.1%升汞混合液、0.1%升汞消毒;当年生嫩条顶端10 cm长度的茎段为最佳外植体;外植体在MS+1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+1.0 mg/L 2,4-对氯苯氧乙酸（2,4-D）+0.8 mg/L赤霉素（GA₃）的培养基中,能诱导出长势健壮的不定芽;在MS+0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L萘乙酸（NAA）的增殖培养基中,增殖系数达2.02;而生根以1/2 MS+0.6 mg/L吲哚-3-丁酸（IBA）+0.4 mg/L NAA培养基为最佳,生根率达100%;对组培苗进行炼苗后覆膜保湿,移栽存活率可达92%。本研究获得了适合绿桐快速繁殖的培养基,建立了一套绿桐快速繁殖体系。     

酿酒酵母高产菌株的木薯酒精产业化生产试验

【目的】对酿酒酵母高产菌株Ygxas-49木薯酒精产业化应用进行试验。【方法】先在200t发酵罐进行分批发酵,对该菌株的各个发酵指标进行评估,再将可行的方案进一步放大至年产12万t酒精生产线上进行生产稳定性试验,最后为考察该菌在产业化应用上的潜力,在200t发酵罐进行高浓度酒精发酵试验。【结果】200t发酵罐分批发酵结果表明:与生产对照菌株相比,酒度提高8.92%,发酵时间减少12h以上,其他发酵指标基本相同。采用该菌株生产酒精可以提高酒度,大大节约发酵时间,增加设备利用率,从而降低酒精生产成本。12万t酒精生产线稳定运行30d结果表明:与生产对照菌株相比,酒度提高5.35%,发酵时间减少10h以上,其他发酵指标基本相同。200t发酵罐高浓度酒精发酵结果:酒度为15.1%(V/V),发酵时间为56h,与目前文献报道最高生产水平(酒度13.5%,V/V;发酵时间69h)相比,酒度提高11.85%,发酵时间缩短13h。【结论】Ygxas-49菌株应用于工业化生产,各项工艺指标均显著优于国内目前最高水平,具有良好的工业化应用前景。     

木薯生料发酵生产高浓度燃料乙醇工艺研究

【目的】对木薯生料发酵生产高浓度燃料乙醇的工艺进行研究,为其工业化生产奠定基础。【方法】首先通过单因素试验确定发酵中主要影响因素的最佳水平,然后利用响应面法对主要因素的相互作用进行研究,最后对发酵温度进行梯度降温控制,以提高乙醇的产量。【结果】单因素试验确定主要影响因素的最佳水平:颗粒淀粉水解酶用量为0.8GAU/g木薯粉,底物浓度为36%(W/V),初始pH值为4.2。响应面法优化的结果:颗粒淀粉水解酶用量为0.82GAU/g木薯粉,底物浓度为37%(W/V),初始pH值为4.3。对发酵温度进行梯度降温控制,则可降低醪液残糖,提高原料转化率。在技术集成基础上,对木薯生粉发酵96h,醪液乙醇产量可达16.24%(V/V),残还原糖含量为0.29%(W/V),残总糖含量为1.81%(W/V)。与初始条件相比,乙醇产量提高25%。【结论】木薯生料发酵生产高浓度燃料乙醇,在技术集成基础上可降低能耗,节约生产成本,具有较好的工业化应用前景。     

新型Ⅰ型普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质

【目的】筛选并克隆表达高酶活且具有一定热稳定性的新型普鲁兰酶。【方法】克隆Tumebacillus flagellatus GST4的普鲁兰酶基因pulB,构建重组质粒后转化宿主菌大肠杆菌进行诱导表达,再运用亲和层析进行纯化并分析其酶学性质和结构。【结果】pulB在大肠杆菌中实现可溶性表达,发酵液上清酶活力达到78U/mL,粗酶液经纯化后比活力为258U/mg。重组酶PulB最适反应温度和pH值分别为55℃和5.0,在较窄的酸性范围内(pH值4.5~5.5)酶活力比较稳定;对普鲁兰糖的Km=(16.28±0.03)mg/mL,Vmax=(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1。PulB的DNA序列与GenBank数据库里的任何序列都没有同源性,在蛋白质序列上,由基因pulB编码的氨基酸序列与T.aegyptius的环麦芽糖糊精酶相似性最高,BlastX比对的Identities为54%,Positives为69%,SMART结构预测分析发现,pulB具有淀粉酶的结构域。底物特异性分析表明,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉生成线性的低聚糖或麦芽三糖。【结论】重组酶PulB是尚未报道的新型普鲁兰酶,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉,属Ⅰ型普鲁兰酶。     

黄浆水与木薯粉混合发酵高浓度乙醇的发酵条件

以黄浆水与木薯粉混合同步糖化发酵高浓度乙醇,应用Plackett—Burman设计对底物浓度、尿素、糖化酶、液化酶、MgSOa、pH值、CaCl2、KH2PO4,8个因素进行2水平12次试验,研究发酵的最佳条件。结果发现,底物浓度、尿素、糖化酶和KH。PO。的添加量是影响发酵的重要因素,最佳发酵条件是底物浓度38％、尿素0．15％、糖化酶1．45AGU／g、KH2PO4 0．07％。在最佳发酵条件下,乙醇浓度达到17．21％（v／v）。     

酶法制备粉状木薯淀粉胶黏剂反应条件的研究

【目的】研究利用α-淀粉酶对木薯淀粉进行降解制作粉状木薯淀粉胶黏剂的方法。【方法】通过单因素和正交实验确定酶水解木薯淀粉的最佳工艺条件。【结果】酶水解木薯淀粉的最佳工艺条件为:A2C3B2,即酶用量为1.0%,酶解温度为45℃,酶解时间为15min。按此条件所得的成品木薯淀粉胶的粘合强度为13.9038N·cm-2,粘度为1.0477Pa·S,不添加其他物质,粘合强度强,流动性非常好。【结论】该方法具有低成本,无污染和高效的特点。     

生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达

【目的】研究生淀粉结合域SBD及糖化酶基因在毕赤酵母中的融合表达,提高酶的表达量和水解生淀粉的能力。【方法】利用In-fusionTM PCR克隆技术将淀粉结合域SBD无缝隙插入到黑曲霉糖化酶基因glu的5′端构建融合表达质粒pPIC9K-psg,实现融合酶基因psg在毕赤酵母GS115中的高效表达,并进行酶学性质研究。【结果】融合酶的最适作用条件及热稳定性均与原始酶无明显差别,但反应温度及pH值的范围更为宽泛,在反应温度60~70℃,pH值为4.0~7.0时均较稳定;融合酶PSG降解生淀粉的能力较原始酶PG提高29.6%,比原始菌株提高86.5%。【结论】淀粉结合域SBD的融合提高了糖化酶水解生淀粉的能力。     

耐热α-淀粉酶的筛选、基因克隆和酶学性质分析

【目的】筛选耐热α-淀粉酶并实现异源表达,同时分析其酶学性质特征。【方法】以M9培养基加上可溶性淀粉作为选择性分离培养基,从腾冲火山温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-3。根据淀粉酶氨基酸保守序列,设计引物进行PCR扩增,然后对目标序列进行步移扩增,获得淀粉酶基因AmyGX。将AmyGX与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】AmyGX基因长1 515 bp,编码505个氨基酸残基,前23个氨基酸残基为信号肽序列;重组质粒pQE30-AmyGX编码的蛋白分子量为58.04kDa,对可溶性淀粉催化水解反应的最适温度为60℃,最适pH值为8.0,V_(max)、K_m值分别为0.19U/mg、3.14mg/mL,热半失活温度T_(50)~(30)值为65.2℃;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)对该酶具有明显的抑制作用,Na~+、K~+对该酶有激活作用,Mg~(2+)、Ca~(2+)的影响则不明显。【结论】AmyGX是一种中等耐温碱性酶,在造纸、洗涤剂生产和有毒废弃物去除等方面具有潜在的应用前景。     

林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应

为探究酚酸类成分对林下连作参根际土壤中微生物区系及可培养细菌群落的影响，以未栽培人参(Panax ginseng C.A.Meyer)林地土壤(1#样品)、连作未发病土壤(2#样品)和连作发病土壤(3#样品)为研究对象，探究根际土壤中微生物区系及可培养细菌群落结构、多样性的变化。同时，通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析方法对土壤样品中的酚酸进行定性和定量分析。结果表明，2#样品和3#样品土壤可培养微生物总数量与1#样品相比分别下降61.37%和68.24%;可培养细菌分别下降61.36%和68.18%;可培养放线菌分别下降72.97%和75.68%;可培养真菌分别为1#样品的1.40倍和0.47倍。3种样品共分离到193株细菌，分属于4门6纲13目19科39属96种。3种样品中最优势菌纲均为芽孢杆菌纲Bacilli(相对分离频率分别为51.67%、64.00%、48.28%),1#样品、2#样品最优势菌属为芽孢杆菌属Bacillus(相对分离频率分别为15.00%、21.33%),3#样品最优势菌属为链霉菌属...