温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

产生淀粉糖化酶菌株的分离以及酶性质的初步研究

从霉变物、土壤、醋曲、醋醅等分离出四株产生淀粉糖化酶且酶活较高的菌株,选取酶活最高的菌株vin-1作为出发菌株,初步鉴定为Aspergillus niger,其生淀粉糖化酶活力达到342U/g(干曲),酶最适作用温度为55℃,酶在pH值3．5～4．5之间有较高的酶活,最适pH值为4．0,Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有一定的激活作用,而Fe~(2+)、K~+、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)都有较强的抑制作用,Mn~(2+)抑制作用最大,达到近50%。     

淀粉酶高产菌株筛选及发酵条件优化研究

从济源市麦田的土壤中筛选工业生产上有潜在应用价值的高产淀粉酶菌株,通过平板初筛和摇瓶复筛,得到高产淀粉酶细菌菌株P11 (2).对其产酶条件进行优化,最终得到最适碳源为可溶性淀粉,最适氮源为酵母粉和蛋白胨组合,加入MgSO4可以促进产酶,加入CaCl2或FeSO4抑制产酶.经正交试验确定培养基的最优组成,优化后的培养基...     

耐热α-淀粉酶的筛选、基因克隆和酶学性质分析

【目的】筛选耐热α-淀粉酶并实现异源表达,同时分析其酶学性质特征。【方法】以M9培养基加上可溶性淀粉作为选择性分离培养基,从腾冲火山温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-3。根据淀粉酶氨基酸保守序列,设计引物进行PCR扩增,然后对目标序列进行步移扩增,获得淀粉酶基因AmyGX。将AmyGX与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】AmyGX基因长1 515 bp,编码505个氨基酸残基,前23个氨基酸残基为信号肽序列;重组质粒pQE30-AmyGX编码的蛋白分子量为58.04kDa,对可溶性淀粉催化水解反应的最适温度为60℃,最适pH值为8.0,V_(max)、K_m值分别为0.19U/mg、3.14mg/mL,热半失活温度T_(50)~(30)值为65.2℃;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)对该酶具有明显的抑制作用,Na~+、K~+对该酶有激活作用,Mg~(2+)、Ca~(2+)的影响则不明显。【结论】AmyGX是一种中等耐温碱性酶,在造纸、洗涤剂生产和有毒废弃物去除等方面具有潜在的应用前景。     

一株高温酸性淀粉酶产生菌的分离、筛选、鉴定及其酶学性质研究

淀粉酶作为水解淀粉和糖原的酶类,在生物的新陈代谢和工业化生产中起着广泛而重要的作用,尤其是高温淀粉酶在利用过程中备受关注.从云南大理市弥渡县石夹泉热泉的43℃底泥中分离并筛选到1株高温淀粉酶的高产菌,进行显微形态及生理生化特征、16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的一株菌,命名为Bacillus sp. Amy-43.对其生长条件及酶学性质进行了研究,结果表明:该菌株耐高温性较好,菌株在55℃仍能生长,菌株最适生长温度为37℃.所产淀粉酶最适酶活温度为75℃,最适反应p H值为4.0.在37℃以下,能保持良好的稳定性,Zn2+和Mn2+对该酶有一定的抑制作用,而Ca2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均对该酶活力起到促进作用,其中Cu2+的促进效果最为明显.这些特性预示着Bacillus sp.Amy-43来源的淀粉酶为工业运用提供了重要的酶源.     

结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定

从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40. 06 k D.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,表明两者均仅具有羧甲基纤维素钠活性,纤维素酶EGT和EG的最适反应温度分别为45℃和55℃,EGT更加耐高温.最适pH均为7. 0,都具有较好的pH稳定性.Mn~(2+)、Fe~(2+)对两者具有激活作用,Zn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、NH_4~(2+)和Mn~(2+)对其都具有抑制作用.EGT的K_m=3. 09 mg/mL,比酶活为98. 4 U/mg; EG的K_m=8. 654 mg/mL,比酶活为53. 53 U/mg. EGT结合区的部分缺失导致酶与底物的亲和能力更好,同时比酶活提高183%,水解能力更强.     

球孢白僵菌017壳聚糖酶的研究I酶制剂的基本特征

球孢白僵菌017突变菌株(Beauveria bassiana 017)在CTN培养基(含0.2～1％壳聚糖,0.075％KH_2PO_4,0.05％MgSO_4,0.05％NaCl,0.001％FeSO_4,0.3％KNO_3,0,1％牛肉膏,pH5.0)中,20～30℃,200r·p·m振荡培养7天,可以分泌大量的胞外壳聚糖酶,对底物水解的最适温度为45～50℃,最适pH值为3.8～4.0。K_m值和V_(max)分别为2.17×10~(-6)M和0.45μmol/min,60℃保温1小时,剩余酶活性为10％,Ca~(2+),Mn~(2+)和Mg~(2+)对酶有激活作用,Cu~(2+)和Fe~(3+)对酶有部分抑制作用,Hg~(2+)和Ag~+则强烈抑制酶的活性。     

生淀粉糖化菌NL—3的发酵条件

以黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ）５２３原生质体为对象,经激光、紫外线和亚硝基胍复合诱变,选育出高产生淀粉糖化酶突变株黑曲霉ＮＬ３,其生淀粉酶活力为１５６Ｕ／ｍｌ．产酶最适培养条件为：起始ｐＨ４５,３０℃,９６ｈ产酶量达最高．Ｋ＋,Ｍｇ２＋对ＮＬ３产生淀粉糖化酶有促进作用;Ｚｎ２＋对产酶有抑制作用．酶的最适作用条件为：以玉米淀粉为底物的最适温度５０℃,最适ｐＨ４５;以甘薯淀粉、马铃薯淀粉为底物时最适温度６０℃,最适ｐＨ４０～４５．酶在６０℃保温１５ｍｉｎ,玉米淀粉为底物时酶剩余活力为８０％;甘薯淀粉、马铃薯淀粉为底物时酶剩余活力为９８％．     

土壤中产a-淀粉酶菌株的分离和筛选

目的：从土壤中筛选产a-淀粉酶活力较强的菌株并对其酶学性质进行初步研究。方法：结合选择性分离培养,碘液检测法,酶活力测定和形态学检测等方法从土壤中分离出产酶活力较强的菌株,并对其所产仅一淀粉酶的最适反应温度和pH值进行研究。结果：共分离到4株能产a-淀粉酶的菌株,其中菌株4产酶活力最高。该菌株所产仅一淀粉酶最适反应温度为50～60℃,最适pH值为6．2。结论：分离到1株产a-淀粉酶酶活力较强的芽孢杆菌,所产仪一淀粉酶属于中温淀粉酶,最适pH值为6．2。     

地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶产麦芽糖特性研究

为了开发新的生产麦芽糖浆的淀粉酶,在大肠杆菌中表达了一个地衣芽胞杆菌(Bacillus lichen form is)麦芽糖α-淀粉酶,并对该酶产麦芽糖的特性进行研究.结果显示,重组酶分子大小为65 kDa,以淀粉为底物的最适温度为45℃,最适pH值为6.5.以浓度为20％的可溶性淀粉为底物,加入106U/g淀粉的地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶,反应48h,采用HPLC检测产物,产物中只有葡萄糖和麦芽糖,其中麦芽糖含量为52.21％,还原糖得率为72.1％;当加入1U/g淀粉的普鲁兰酶协同作用进行反应时,产物中麦芽糖的含量增加到57.16％,还原糖得率增加到92.5％.该酶在麦芽糖浆的工业生产上有较大的潜在应用价值.     

耐酸性α-淀粉酶的分离提取及性质研究

目的 以选育得到的耐酸性α-淀粉酶生产菌株黑曲霉Tx-78为出发菌株.对耐酸性α-淀粉酶的分离提取方法 及其性质进行研究.方法 通过液体发酵、减压浓缩及进一步提取得到粗酶制剂,对其最适宜反应温度、pH进行测定,对其稳定性及动力学性质进行研究.通过薄层层析对其水解淀粉的最终产物进行分析.结果 该酶最适宜反应pH为4.0,最适宜反应温度为70℃.当Ca2 浓度为7 mmol/,L时其作用最明显.动力学研究表明该酶的Km值为7.89 g/L.薄层层析结果 表明,该酶制剂水解淀粉最终产物为麦芽糖和葡萄糖.结论 该酶具有良好的耐酸性和耐热性.Ca2 对其有促进作用,能够实现在酸性条件下淀粉液化和糖化的同步进行,具有良好的应用前景.     

高产芽孢杆菌MS12木聚糖酶发酵条件优化及酶学性质研究

从昆明某磷矿土壤中筛选出一株产木聚糖酶能力较强的菌株——MS12,通过单因素试验初步优化了该菌株的产酶条件.试验结果显示,该菌株最佳产酶培养基为玉米芯粉50 g/L、麸皮40 g/L、NH_4Cl 10 g/L、CaCl_2 5 g/L、NaHPO_42 g/L,pH自然;最佳产酶发酵条件为30℃,180 r/min,装样量30 mL/250 mL三角瓶,震荡培养96 h.经测定,菌株MS12所产木聚糖酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7.0,具有较好的pH稳定性. 1 mmol/L Na~+、Ba~(2+)和10 mmol/L Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶活有促进作用,Ag~+对酶活有明显的抑制作用.     

K_(123)菌株普鲁兰酶(Pullulanase)的合成及其酶性质的研究

研究了一株从白酒发酵现场分离得到的Ｋ１２３菌株普鲁兰酶的合成及其部分酶性质．结果是Ｋ１２３菌株的异淀粉酶在培养液中的大量积累发生在稳定期后期,菌的最适生长温度为３５℃,产酶的最适温度则为３０℃;菌的最适生长ｐＨ和产酶的最适ｐＨ均在７．０～７．５;产酶的最佳碳源为可溶性淀粉,有效碳源是糯米淀粉、糊精、支链淀粉、玉米面、茁霉多糖、麦芽糖,而葡萄糖则抑制产酶;产酶的最佳氮源是蛋白胨、酪素水解物,无机氮源则使得Ｋ１２３菌株的产酶量略低于有机氮源．通气量对菌体的生长影响较大,但菌体的生长达稳定期后,通气量的改变对菌的产酶影响不大．Ｋ１２３菌株所产的异淀粉酶水解茁霉多糖的产物为麦芽三糖,不水解动物淀粉,是普鲁兰酶（ｐｕｌｕｌａｎａｓｅ）．该酶反应的最适温度为５０℃,最适ｐＨ５．８,受Ｃａ２＋,Ｍｎ２＋等离子激活,受Ｃｕ２＋,Ｚｎ２＋等离子抑制;该酶的热稳定性较差,５０℃以上迅速失活;ｐＨ稳定性较好,中性,微酸性条件下,冰箱中可长期保存．该酶应用于固态白酒发酵可提高出酒率平均４％以上．     

一株α-淀粉酶生产菌的分离鉴定及其产酶条件优化

平板水解圈法从土壤中分离产淀粉酶菌株。通过碘比色法测定产淀粉酶分离菌株的酶活,筛选出一株产酶量较高的菌株,鉴定其种类,并对其产酶条件优化及酶学性质进行研究。通过革兰氏染色、生化鉴定和16SrDNA序列比对鉴定该菌的种类;从pH、温度、碳源、氮源等方面进行产酶条件优化。菌种经16S rDNA PCR序列分析比对,为枯草芽孢杆菌,因此将分离到的菌株命名为Bacillus subtislis-Y9;菌株最佳培养基配方为：淀粉6g,酵母膏13g,氯化钠5g,添加1.0%的吐温于1000mL蒸馏水中;最佳培养条件为：初始pH值为7.5;培养温度为37℃,培养时间36h。在上述培养基和优化培养条件下菌株发酵液的α-淀粉酶酶活达到7.1U/mL,约为出发菌种的5.5倍。酶学研究显示,α-淀粉酶的最适反应温度为40～60℃,反应体系pH值为6.6,并需添加0.5%CaCl2。     

一株产α-淀粉酶芽孢杆菌的分离及产酶条件的优化

以筛选与鉴定尉犁县黑湖产淀粉酶细菌,并对筛选出的细菌进行产酶条件优化为研究目的,从43株细菌中筛选出淀粉酶高产菌株HM-22,并对其进行了菌株形态学鉴定、16S r DNA分子鉴定以及产酶条件优化。从尉犁县黑湖采样的30个水、土和泥样样品中分离筛选43株细菌,从中筛选出14株产淀粉酶的菌株,采用Yoo改良法对产透明圈较大的菌株进行酶活力测定,从中筛选出了一株产酶活性较高的菌株HM-22。经革兰氏染色、菌落形态观察、生理生化检测和16S r DNA序列比对鉴定该菌与Bacillus tequilensis的相似性为99.8%,属于芽孢杆菌属。对菌株HM-22产酶条件进行初步优化确定其产酶的最佳条件是:该菌产淀粉酶最适温度为40℃,最适碳源为可溶性淀粉,最适氮源为牛肉膏,最适反应pH为6.0,最适产酶培养时间为24 h。优化后菌株HM-22的酶活力从最初的的酶活力122.45 U/m L达到147.53 U/m L,酶活力提高了17%。该研究为从新疆盐湖细菌中筛选淀粉酶活力较高的菌种资源及应用提供了理论依据和参考。     

高产新型淀粉酶菌株MS5.1的选育\=及最适产酶条件

从原筛选的产酶菌株芽 孢杆菌 (Bacillus Stearophilus) BS3.232出发, 经亚硝基胍多次诱变、 初筛和复筛后 , 获得了产酶水平明显提高的变异菌株MS5.1, 其产酶水平为原株的 153.8%. 薄层分析证 明, 该酶能催化淀粉的水解和转苷, 产物为异麦芽低聚糖, 包括异麦芽糖、 潘糖、 异 麦芽三糖和异麦芽四糖. 表明MS5.1产生的新型淀粉酶能有效地转化淀粉产生异麦芽低聚糖. 用正交法确定了MS5.1菌株的最适产酶条件： 通气量在60%以上, 55 ℃培养24 h. 实验结果表明, 培养温度是影响产酶水平的最主要因素.     

重组草酸青霉生淀粉糖化酶的酶学特性鉴定

【目的】了解在毕赤酵母中表达的来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)GXU20的重组生淀粉糖化酶的酶学特性。【方法】用3,5-二硝基水杨酸法测定pH值、温度、金属离子和化学试剂对纯化的重组生淀粉糖化酶的活力的影响,同时测定酶的底物特异性、酶对生淀粉的吸附能力以及酶对不同生淀粉的水解效率等,用高效液相色谱法对该酶水解生木薯淀粉的产物进行分析鉴定,用扫描电子显微镜观察重组酶对不同生淀粉颗粒的水解方式。【结果】重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的最适pH值为4.5,最适温度为65℃,在pH值为2.0~10.0时,重组酶具有较好的pH耐受性,温度小于50℃时,酶的稳定性好。除Ag~+、Cu~(2+)和SDS之外,其他大部分金属离子和化学试剂对重组酶的酶活力影响不大。重组生淀粉糖化酶对大米和玉米生淀粉的活性较高,对木薯和马铃薯生淀粉的活性次之,重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同生淀粉的吸附能力与其对相应不同生淀粉的水解活性大小呈正相关。扫描电子显微镜观察表明重组生淀粉糖化酶对不同生淀粉颗粒的降解作用明显,水解方式各有特点。高效液相色谱分析表明该重组生淀粉糖化酶水解生木薯淀粉的产物仅有葡萄糖。重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在40℃下对大米和玉米生淀粉水解72h后水解率分别达到86.5%和71.9%。【结论】重组生淀粉糖化酶具有广泛的pH耐受性,对生淀粉具有高水解活性,在生淀粉的水解和生料同步糖化发酵生产酒精中有一定的应用潜力。     

莲子浆的酶解条件探索研究

通过α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、胰蛋白酶处理莲子浆,探索出了酶解莲子浆的最佳工艺条件.实验表明,在pH值为6.5,温度95℃下α-淀粉酶水解的最佳条件为酶与底物之比为24U/g莲子、底物浓度5%、水解时间为30min;在pH值为4.0,温度60℃下葡萄糖淀粉酶糖化的最佳条件为酶与底物之比为10000U/g莲子,底物浓度为11%,时间为11hr;在pH值为7.5,温度40℃下胰蛋白酶水解的最佳条件为酶与底物之比为16 000U/g莲子、底物浓度5%、水解时间为5hr.水解率可达56.25%,可得澄清透明的莲子原液.     

用蕉芋淀粉酶法制造果葡糖浆

本文研究了以蕉芋淀粉为原料,用淀粉酶和固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆的各种最适条件,包括pH、酶浓度、底物浓度、金属离子、温度、时间等因素。结果表明,α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶水解蕉芋淀粉的葡萄糖值可达95一99%。固定化葡萄糖异构酶转化葡萄糖为果糖的转化率可达45-54%,其甜度超过同浓度的蔗糖。通过与木薯、甘薯淀粉比较实验表明,蕉芋淀粉是制造果糖的良好原料,而且,它在长江以南均可普遍栽培。     

两个苹果酸酶的表达和酶学性质分析

为了探讨深黄被孢霉M6-22中不同苹果酸酶的性质,研究从深黄被孢霉M6-22中克隆得到苹果酸酶MIME1基因并在大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和NADPH,具有苹果酸酶的特性.同时与前期获得的MIME2进行酶学性质分析.结果显示,重组表达的MIME1和MIME2都具有苹果酸酶的性质,但MIME1的最适温度和最适pH分别为28℃和7.5,MIME2的最适温度和最适pH分别为30℃和5.8,而且在最适温度和最适pH条件下所纯化的MIME1和MIME2酶活分别为292.84 U/mg和235.14 U/mg.进一步酶学性质分析表明,Mg~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn ~(2+)可以提高MIME1的活性,其中Cu~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Ca~(2+)、Mn~(2+)对MIME1的活性则有抑制作用;Mn~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)和Ca~(2+)对MIME2表现出不同程度的激活作用,其中Mn~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Cu~(2+)和Zn~(2+)则对MIME2的酶活表现出明显的抑制作用.这些分析结果表明,同一种细胞中不同的苹果酸酶具有不同的酶学性质,这可能与它们执行不同的生物学功能有关.通过异源表达和分离纯化,研究初步揭示了2个深黄被孢霉M6-22苹果酸酶的一些酶学性质特点,这为以后深入研究该苹果酸酶结构和功能以及与M6-22菌株油脂积累的关系提供了理论依据和参考.