利用PCR-DGGE技术分析硫化镍矿浸矿体系中的细菌群落演替

 浸矿体系中的菌群结构及其演替规律与浸出率具有密切的关系,为了解硫化镍矿浸矿体系中的这种关系以提高浸出率,利用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术结合16S rRNA基因序列对体系的细菌种群结构进行分析.研究表明,在硫化镍矿浸矿体系中,菌群组成菌属为嗜酸氧化亚铁硫杆菌属(Acidithiobacillus),并在浸矿体系中具有明显的演替现象,浸矿体系中的菌株演替和浸出率具有明显的相关性,经过21d的浸出,硫化镍矿的浸出率达到70%,探索浸矿体系中细菌的种群结构及其演替与浸出率的关系,对优化浸出体系菌群组成,提高浸出率具有指导作用.     

粘质沙雷氏菌抗铜基因的克隆及性质研究

 通过构建粘质沙雷氏菌KMR-3菌株的基因组DNA文库,克隆到了与该菌的铜抗性相关的基因,并对其部分特性进行了研究.结果表明克隆到的铜抗性基因所编码的蛋白属于CutF蛋白,由194个氨基酸编码,与莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC43969抗铜脂蛋白NlpE同源性最高,达到70%,并对该基因的调控序列(启动子、终止子、SD序列及转录起始位点)进行了分析.     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

两个苹果酸酶的表达和酶学性质分析

为了探讨深黄被孢霉M6-22中不同苹果酸酶的性质,研究从深黄被孢霉M6-22中克隆得到苹果酸酶MIME1基因并在大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和NADPH,具有苹果酸酶的特性.同时与前期获得的MIME2进行酶学性质分析.结果显示,重组表达的MIME1和MIME2都具有苹果酸酶的性质,但MIME1的最适温度和最适pH分别为28℃和7.5,MIME2的最适温度和最适pH分别为30℃和5.8,而且在最适温度和最适pH条件下所纯化的MIME1和MIME2酶活分别为292.84 U/mg和235.14 U/mg.进一步酶学性质分析表明,Mg~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn ~(2+)可以提高MIME1的活性,其中Cu~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Ca~(2+)、Mn~(2+)对MIME1的活性则有抑制作用;Mn~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)和Ca~(2+)对MIME2表现出不同程度的激活作用,其中Mn~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Cu~(2+)和Zn~(2+)则对MIME2的酶活表现出明显的抑制作用.这些分析结果表明,同一种细胞中不同的苹果酸酶具有不同的酶学性质,这可能与它们执行不同的生物学功能有关.通过异源表达和分离纯化,研究初步揭示了2个深黄被孢霉M6-22苹果酸酶的一些酶学性质特点,这为以后深入研究该苹果酸酶结构和功能以及与M6-22菌株油脂积累的关系提供了理论依据和参考.     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

低温脂肪酶产生菌筛选与鉴定、产酶条件及酶学性质研究

 昆明东站一家屠宰厂冷库中筛选到14株产脂肪酶低温菌株.选取1株胞外低温脂肪酶高产菌,进行显微形态及生理生化特征、16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为Yersinia enterocolitica的一株菌,命名为KM1.对该菌发酵产酶条件研究,发现其最佳产酶发酵条件为:培养温度13℃,pH7.2,摇瓶培养时间54h.在最佳产酶发酵条件下酶活由1.8U/mL提高到3.1U/mL,提高了72%.对该菌脂肪酶的酶学性质研究表明:在0℃时仍具有最高酶活的20%,最适反应温度37℃,最适反应pH为9.0.在25℃以下,pH7.2～10范围内均能保持良好的稳定性.该酶在有机溶剂中较稳定,即使在50%的甲醇中仍能保持60%以上的活性,该酶的最适底物为C₈的酯化物,且对C₄～C₁₂的酯化物均有较好的催化能力.     

mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异

mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.     

一个假单胞菌MY1402基因启动子的分离与鉴定

利用构建的启动子探针载体pUE,以大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α作为宿主菌,从耐低温假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株MY1402分离基因启动子片段,获得7个具有不同大小的启动子功能片段的重组子,命名为pUE1～pUE7.将其中具有p1片段的重组子PUE1导入假单胞菌MY1402中进行卡那霉素耐受浓度分析,结果显示阳性转化子MY1402/pUE1的最高耐受浓度为250 mg/L,而且在相同抗生素浓度下培养温度从28℃降到15℃并不影响转化子MY1402/pUE1的生长,表明pUE1中的插入片段p1具有低温启动子的活性.将所预测的p1核心序列p1a通过化学合成并连接到探针载体pUE上,构建出重组质粒pUE1a并转化MY4102中进行功能分析.结果显示,28℃条件下p1a片段仍保持相同强度的启动子活性,但15℃条件下活性下降明显,卡那霉素质量浓度高于100 mg/L基本没活性,表明p1a两端序列可能与p1低温转录启动活性有关.     

低温菌穿梭质粒的构建及转化方法研究

 由于低温微生物在细胞结构上的特殊性,使得对它们进行遗传操作受到很大的限制.以分离自冻土的低温菌Acinetobacter sp.DWC6为宿主菌,构建了一套外源DNA导入系统.通过在质粒pBR322和pUC118中插入一段Acinetobacter属特异性的Ori片段,成功构建了一系列穿梭质粒,并建立了稳定的转化方法,所有重组质粒均可在Escherichia coli和Acinetobacter sp.DWC6中正常复制.通过优化转化方法,使质粒在低温菌Acinetobacter sp.DWC6中的转化率达3×10⁶转化子/μg DNA.