嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3蛋白酶基因的原核表达、纯化和性质表征

将来源于嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的蛋白酶(PH1704)基因在大肠杆菌BLP-CodonPlus中高效表达.采用超声、热失活和HiTrap Q Sepharose柱层析等方法对产物进行分离纯化.通过SDS-PAGE,Native-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,发现该重组酶以十二聚体为主的寡聚体形式存在,并具有SDS抗性.蛋白酶活力染色表明,其六聚体以上有活力.以azo-gelation为底物,对其酶学性质进行初步研究表明,其最适温度为85℃,最适pH=8.0,并且具有良好的热稳定性.     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达及重组酶性质测定

将不含信号肽的瑞氏木霉内切葡聚糖酶II(Cel5A)的cDNA克隆到pET-28a(+)表达质粒上,与其N末端6个组氨酸标签序列融合,构建成pET-28a(+)-egl2表达质粒,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达.利用低温诱导策略,成功表达出活性重组蛋白.Western blot 结果显示重组Cel5A相对分子分量大约为43 000.进一步对重组Cel5A进行Ni-NTA亲和层析柱纯化并对其进行酶学性质测定,结果显示以羧甲基纤维素钠为作用底物时重组酶最适作用pH为4.5,最适作用温度为60℃;重组酶热稳定性较好,在65℃及以下保温1.5 h,活性仍相当稳定.Mn2+对Cel5A的酶活有促进作用,Fe3+和Cu2+有抑制作用,其它金属离子和EDTA对酶活没有明显影响.底物特异性研究表明,重组Cel5A只能水解混合键葡聚糖和羧甲基纤维素钠,对混合键葡聚糖的水解能力是其对羧甲基纤维素钠水解能力的6.7倍,但对微晶纤维素、Glass microfiber filters、木聚糖、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖没有水解作用.     

β-琼脂糖酶(AgaA7)在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为研究重组β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的表达产物及其酶学性质,根据GeneBank中β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体pET-22b( )中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并测定其酶学性质.结果表明:重组酶的相对分子质量为~5.0×104,与预期相符.此酶最适反应pH是7.0,在pH58的缓冲液中最稳定;最适反应温度为50℃,在低于50℃时比较稳定.Na ,K ,Ca2 ,Mg2 对重组酶活性影响不大,而Zn2 ,Hg2 ,Pb2 则对酶活性具有不可逆抑制作用.     

纤维微菌海藻糖合成酶基因克隆表达及酶学特性鉴定

【目的】开发适用于海藻糖生产的新型海藻糖合成酶。【方法】通过反向PCR技术,从一株纤维微菌的基因组DNA中获知海藻糖合成酶基因完整ORF序列,进而克隆得到纤维微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS),将其与表达载体pSE380构建重组质粒后转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,通过镍柱亲和层析纯化得到纯酶并进行酶学性质测定。【结果】从纤维微菌中克隆并在大肠杆菌中成功表达海藻糖合成酶基因(CCTreS)。经纯化获得的重组酶(CCTreS)在以麦芽糖为底物生成海藻糖时,最适反应pH值为7.0,最适反应温度为45℃,40℃保温1h仍具有80%以上的相对酶活力,在pH值5.5~8.5保存24h,相对酶活力仍保留80%以上。Cu~(2+)对其有明显抑制作用。【结论】该重组酶具有很好的热稳定性和pH稳定性,具有一定的研究价值和潜在的工业应用价值。     

肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)基因组为模板,通过PCR扩增得到其漆酶基因lac;基于毕赤酵母密码子偏爱性优化后,得到新型漆酶基因lacm;将其与大肠杆菌–毕赤酵母(E. coli-P. pastoris)穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-lacm;将该质粒转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中,实现该漆酶的胞外分泌表达,发酵液中重组漆酶(rLACM)活力达0.37 U/m L.经对rLACM酶学性质分析表明:rLACM的最适温度为70℃,最适pH为8.0,在30～70℃、pH 5.0～9.0活力稳定.     

草鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究

通过DEAE-Sephacel离子交换层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析和Phenyl Sepharose 6-Fast Flow疏水层析,从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉中分离纯化得到了一种亮氨酸氨肽酶,并对其生物化学性质进行了研究.结果表明,草鱼肌肉亮氨酸氨肽酶分子量约为105 ku,是单体结构.最适温度为40 ℃,最适pH为7.5,属于金属蛋白酶.除了Leu-MCA,该酶对其它多种荧光合成底物也有一定程度的分解作用,但对内肽酶对应的荧光底物则没有分解作用.     

Klebsiella sp.GXK-1的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

【目的】克隆、表达克雷伯氏菌Klebsiellasp.GXK-1菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,并研究重组酶的酶学性质。【方法】比对分析GenBank数据库中克雷伯氏菌同属的α-L-鼠李糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因的保守区。扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-rha1,并在大肠杆菌E.coli XL-blue进行诱导表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究目的蛋白RHA1的酶学性质。【结果】以pNPR为底物,进行重组酶酶学性质的研究。重组酶RHA1的最适pH值和最适温度分别为5.0和45℃,Km值为(0.223±0.030)mmol/L,V_(max)值为(1.272±0.121)μmol/(min·mg)。在pH值为6~10的缓冲液内酶活力仍保持在80%以上;在温度为40℃以下时,酶活较为稳定,但在温度高于40℃时酶活力迅速下降。RHA1能水解pNPR、橙皮苷和芦丁。【结论】RHA1具有良好的pH稳定性,不仅能够水解人工底物pNPR,还能够水解α-1,6键的天然底物橙皮苷和芦丁,具有一定的医疗应用价值。     

酿酒酵母表面展示脂肪酶LipB52的酶学性质

酿酒酵母表面展示脂肪酶重组菌株EBY100-pLHJ026在含半乳糖(20 g/L)的YNB-CAA培养基中进行诱导表达,脂肪酶在诱导48 h时酶活达到最高。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物对全细胞酶活进行性质检测,结果表明:对硝基苯酚癸酸酯(C10)为最适反应底物;全细胞脂肪酶在pH 8.0时的最适反应温度为37℃,在60℃保温2 h酶活保持90%,在60℃保温3 h酶活保持55%,表现出较好的热稳定性。在等体积二甲基亚砜中处理3 h后酶活保持28.4%。     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶

经过连续易错聚合酶链式反应(Error-Prone PCR)向克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变(A964T),该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol.L-1升高至0.63 mmol.L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol.L-1升高至0.77mmol.L-1,并且酶的最适pH值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65℃降至55℃.     

白虫草多糖的提取及其抗炎功能

用超声波提取法从白虫草（Cordyceps militaris Link）全草中提取多糖, 通过响应面法确定最佳提取工艺, 利用高效液相色谱（HPLC）法检测白虫草多糖的成分, 鉴定其主要的单糖组成, 并利用RAW264.7体外细胞抗炎模型检测白虫草多糖的抗炎效果. 结果表明： 最佳提取工艺为提取温度65 ℃, 超声波功率1 800 W, 提取时间3.0 h, 该条件下的提取率可达31.56%; 其单糖组成分别为Ara,Gal ,Xyl,Man,Glc和Rha; 白虫草多糖具有抗炎活性.     

重组TgoDNA聚合酶的特性

检测了重组Tgo酶的扩增性能、 耐热性以及长距离PCR能力， 结果表明, 该重组酶扩增性能与Taq酶相当； 其耐热性极强， 在 95 ℃ 40 min， 仍具有很强的聚合活性； 利用重组酶在常规PCR条件下， 成功扩增了5.3　kb的拟南芥Timeless基因片段.     

葛根中黄酮提取工艺的优化及抗氧化作用

以时间、温度和料液比3个单因素进行正交实验,确定葛根中黄酮提取的最佳条件.结果表明,提取的最佳条件为:m(料)∶V(液)=(1∶40)g/mL,60℃浸提3h,葛根粗提率为82%,黄酮提取率最高为18.04%.以模式生物秀丽隐杆线虫(线虫)为模型,考察质量浓度分别为1,2,5 mg/mL黄酮提取物对线虫的抗氧化作用.结果表明,在35℃培养12h,1mg/mL黄酮提取物喂食线虫的存活率较对照组有显著提高,即黄酮提取物有明显的抗氧化作用.     

瑞氏木霉QM9414利用蔗渣发酵产纤维素酶的研究

 以蔗渣为培养基料,通过单因子及正交试验,对瑞氏木霉QM9414固体发酵产纤维素酶的产酶条件进行了探讨.其优化的产酶条件为：甘蔗渣2.5g,麸皮1g,加含7.5g/L(NH₄)₂SO₄的Mandels营养液14?mL(干物质(g)与水(mL)的比例为1∶4),调初始pH4.0,30℃发酵120h.在此优化条件下,每克干曲产纤维素酶酶活力可达8.26U.     

紫花苜蓿幼苗对冻融及乙酸钙镁融雪剂胁迫的生理响应

研究紫花苜蓿东苜1号幼苗在乙酸钙镁盐（CMA）胁迫、 人工模拟冻融胁迫（10,5,0,-3,0,5,10 ℃）及冻融与CMA复合胁迫下的叶片相对含水量（RWC）、 净光合速率（A）、 蒸腾速率（E）和水分利用率（WUE）的变化. 结果表明： CMA组均低于对照组（CK）的RWC,A,E和WUE值; 冻融组与复合胁迫组的RWC,A和E值均呈先降低后升高的趋势; 冻融组的WUE值呈先降低后升高再降低的趋势, 且在T2（5 ℃）时达到最小值, 在T5（0 ℃）时达到最大值; 复合胁迫组的WUE值在T5时达到最大值; 苜蓿幼苗的RWC,A和E值呈CMA组<冻融组<复合胁迫组的变化趋势, 即复合胁迫对幼苗的影响更大, 在复合胁迫下, 苜蓿通过关闭气孔降低体内水分消耗, RWC,A,E值大幅度降低以提高苜蓿的抗逆性     

结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因为模板, PCR反应扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因（ICL）, 将其克隆入原核表达载体pET28b中, 并将pET28b I
CL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达. 结果表明, ICL蛋白的最佳诱导表达条件为: 温度20 ℃, IPTG终浓度为025 mmol/L, 诱导表达4 h, 在此条件下 ICL实现了高效表达, 以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化ICL蛋白, 纯化程度较高. 酶学性质鉴定表明, 实验获得了具有生物学活性的重组蛋白, 重组ICL的比活力为24 μmol/(mg·min).     

α-N-乙酰半乳糖胺酶的表达及活性检测

为了建立新型α-N-乙酰半乳糖胺酶的筛选、检测方法，实验中提取脑膜金黄杆菌的基因组DNA，以此为模板PCR扩增出α-N-乙酰半乳糖胺酶(A4).将A4克隆至pET-24a载体，转化Bl21表达菌株进行蛋白表达.使用亲和层析方法纯化His-A4酶，选择显色底物验证酶活性.同时，改进了传统的ELISA方法，直接将红细胞膜包被于ELISA检测平板中，以红细胞膜表面抗原作为直接底物，用ELISA方法检测酶活性.此研究建立了新型ELISA实验方法，以此方法验证了A4酶的活性，证明了此酶能够有效降低红细胞表面抗原抗体反应，且具有浓度和时间依赖性.     

ChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达

 为了使鸡干扰素-γ（ChIFN-γ）基因在油菜中获得高效表达,优化了油菜偏爱的密码子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加内质网滞留信号肽SEKDEL.应用同尾酶将人工合成的ChIFN-γ,Napin特异性启动子及信号肽与NOS终止子克隆到质粒pSH中构建成植物表达载体pSH-NGN.经生菜瞬时表达,ELISA检测表明ChIFN-γ蛋白获得有效表达.研究结果为进一步遗传转化油菜奠定了基础,同时也对构建基因的正确表达提供了一种新的快速鉴定方法.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.