质粒Yp7构建的探讨

以大肠杆菌酵母穿梭质粒YRp7 DNA为材料,经体外重组构建了质粒Yp7。该质粒具有Amp~r、Tet~r两个抗药性标记和一个来自酵母细胞的Trpl基因。分子量约为5.25kb。该质粒可用于筛选水稻等真核生物DNA中的自主复制序列。     

大肠杆菌质粒DNA不同提取方法的比较

实验采用简化的碱法少量提取法、简便快速的煮沸法及试剂盒法提取质粒 p CB30 2 -3.并通过一对特异引物对质粒 DNA进行 PCR(聚合酶链式反应 )扩增 ,分别对各种方法所提取的质粒 DNA及其 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果表明碱法少量提取法和试剂盒法所提取的质粒 DNA纯度和产量高 ,且重复性好 ,达到了分子生物学实验要求 .其中简化的碱法少量提取法具有结果稳定和经济的特点 ,非常适合大多数实验室使用 .     

筛选甘蔗SPSⅢ启动子诱饵片段结合蛋白的酵母单杂交诱饵质粒的构建

主要构建了可以与酵母染色体发生重组的质粒pAbAI-Bait,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获得转化子,将阳性克隆进行PCR与DNA测序的方法鉴定,结果表明: 酵母单杂交中报告质粒pAbAI-Bait构建成功,可用于酵母单杂交体系.     

青檀基因组DNA提取方法的优化

以青檀(Pteroceltis tatarinowii Maxim.)的叶片为材料,采用改良高盐低pH值法、改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法4种不同方法提取其基因组DNA,并进行电泳分析、质量检测及ISSR引物扩增检测.结果表明,改良CTAB法优于其它方法,提取的DNA质量较好,纯度较高,能满足进一步的实验要求.     

甲醇毕赤酵母电转化条件的研究

采用电转化的方法,将携带有tPA355基因的DNA片段转化进甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETα-tPA355对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。     

CLN8P相互作用蛋白靶基因的获取与初步鉴定

为了获得CLN8P相互作用蛋白靶基因并对其进行初步鉴定,实验经抽提酵母质粒DNA,电转化大肠杆菌,选择性培养基分离质粒,酶切鉴定、测序、生物信息学分析,结果获得了CLN8P相互作用蛋白阳性克隆的一个靶基因BAG5;利用酵母双杂交共转化法初步验证,表明BAG5蛋白与CLN8P具有相互作用,并可能因此影响到神经细胞的正常生长.这将有利于进一步深入研究CLN8的功能及阐明NCLs发病机制.     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明:法夫酵母对20μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

人白细胞介素24蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活检测

构建人白细胞介素24蛋白酵母双杂交诱饵栽体,并检测其自激活作用.采用PCR技术特异性扩增人白细胞介素24基因IL-24,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,通过PCR扩增、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-IL-24.采用PEG/LiAc法将其转入酵母AH109中,经表型筛选检测其自激活作用,同时...     

葡萄总DNA提取方法的比较研究

以葡萄幼叶为材料，分别采用溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)法、高盐低pH法、简易法、高盐沉淀法和改良十二烷基硫酸钠(SDS)法5种方法提取总DNA，通过A260／A280值、琼脂糖凝胶电泳和RAPD对5种方法所得DNA溶液进行定量、定性分析和综合比较。结果显示高盐低pH法、高盐沉淀法综合效果较好，改良SDS法所得DNA纯度最佳。因此，在实际工作中还应根据实验目的选取最适合的方法。     

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG -pPIC9K的嗜甲醇酵母     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

一种高效安全提取质粒DNA方法的建立

在碱裂解法提取质粒DNA的基础上做了改进,将NaOH浓度从0.20 mol/L降低为0.10 mol/L,使得超螺旋DNA的得率进一步提高.采用silica法纯化质粒DNA,避免了使用有毒性和挥发性气味的饱和酚和氯仿,使得操作更安全简单.电泳结果表明,提取的质粒DNA质量好,得率高,并且可以直接进行下一步的酶切、连接及转化等实验.同时,该方法中使用的硅胶可以回收再生进行重复利用,节省了实验费用.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticalipase B,CALB)的表达量,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子(10 mmol/L)Ca2+,Zn2+,Mn2+有助于CALB酶活力的提高,而Cu2+,Ag+,Fe3+强烈抑制酶催化反应.     

无形体分泌蛋白Ats-1与宿主细胞互作蛋白筛选及其生物信息分析

目的筛选与无形体Ats-1互作的THP-1宿主细胞蛋白,为揭示病原体侵袭宿主的致病机理提供科学数据。方法利用分子克隆法构建p GBKT7-ats-1诱饵质粒并转化酵母Y2HGold,验证诱饵质粒是否有自激活、毒性现象;制备THP-1细胞c DNA并连接到p GADT7-Rec上,转化酵母Y187并鉴定c DNA文库质量;酵母双杂交筛选与Ats-1互作的宿主细胞靶蛋白,通过GO、String生物信息分析细胞靶蛋白可能的生物学过程。结果成功构建诱饵质粒;cDNA文库容量4×10~6克隆,插入片段100～3 000 bp,且无污染,达到建库质控要求;酵母双杂交结果显示,与Ats-1蛋白互作的宿主细胞靶蛋白7个,分别是真核延伸因子1复合体α1亚基(EEF1A1)、TIMP金属蛋白酶抑制子1(TIMP1)、锌指蛋白36,C3H样2 (ZFP36L2)、半乳糖凝集素1(LGALS1)、前胸腺素α(PTMA)、WBSCR22、吸引素(ATRN)。生物信息分析显示,与Ats-1互作的宿主靶蛋白主要参与细胞分化增殖、细胞凋亡、自噬、炎症等生物学过程。结论病原诱饵蛋白与宿主细胞靶蛋白互作是一种细胞-细胞间发生信号联系的分子水平生物学过程,可能影响病原粘附、侵袭及胞内生存,最终导致疾病发生及临床症状出现。     

假丝酵母Candida sp.发酵生产脂肪酶培养条件的优化

研究了碳源和氮源种类、碳源浓度以及起始pH值对假丝酵母Candida sp.菌株发酵生产脂肪酶的影响.结果显示,最适碳源为橄榄油,氮源为酵母膏,橄榄油浓度为2%,起始pH值为6.0.应用响应面试验设计对酵母膏、橄榄油和起始pH值进行培养基优化,结果表明,优化后的培养基配方为:橄榄油2.582%,酵母膏0.276%,K2HPO4 0.1%,MgSO4·7H2O 0.01%,NaCl 0.05%,pH6.28.在此条件下,假丝酵母Candida sp.液体发酵液中脂肪酶的酶活力可达36 250U·mL-1.     

酵母克隆基因的转化和稳定性检测

采用放射性探针分子杂交技术鉴定及选出重组DNA的可靠转化子。实验结果表明:双倍体受体的转化效率约为单倍体的2倍;含有酵母染色体端粒区GT重复顺序的重组质粒的转化效率约为含染色体内部区GT重复顺序重组质粒的3倍;在克隆基因的稳定性方面,整合型转化子要比自主复制型转化子高得多。因此,用酿酒酵母作基因工程生产菌时以双倍体为好。经分析并证实,含酵母染色体端粒区GT重复顺序的重组子有些具有多靶整合作用,这种整合转化在基因工程中有实用价值。     

乙型肝炎表面抗原基因在酵母中的表达——Ⅰ.HBsAg基因在酵母中的克隆

将乙型肝炎表面抗原基因组装进穿梭质粒,经E.coli扩增、鉴定后转入酵母细胞得到了转化子。经放射免疫分析,在此转化子中HBsAg未得到表达,可能是阅读框架不一致造成的。此外,我们对酵母DNA重组技术进行了摸索,并简化和改进了一些步骤。     

菠菜基因组DNA提取方法与条件的研究

分别采用CTAB、SDS、高盐低pH三种方法从菠菜叶片中提取基因组DNA,通过A260/A280值、A260/A230值和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA进行定量、定性分析和综合比较。研究提取缓冲液用量、水浴时间、蛋白质沉淀剂(氯仿-异戊醇)用量、DNA沉淀剂(异丙醇)用量等条件对DNA提取效率和纯度的影响。并对CTAB法的提取条件进行了正交试验,优选出菠菜基因组DNA提取的适宜条件。     

显色基质法定量测定质粒DNA中的细菌内毒素

探讨使用显色基质法定量测定质粒DNA中细菌内毒素含量的可行性。结果表明，质粒DNA溶液经2倍稀释，对内毒素检测不存在干扰作用，用显色基质法可以定量测定质粒DNA中内毒素含量。显色基质法与家兔热源法比较，有敏捷、快速、定量、稳定可行的优点，其测定结果同家兔热源法结果一致。