重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因及其重组质粒构建

目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列.方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接法将各段拼接成全长为1 443 bp的RV rE1,将E1基因的全长序列克隆导入原核表达载体pET32a.结果:分别进行8轮、5轮和6轮的重叠PCR扩增,合成风疹基因3个片段;以酶切连接法将3个片段拼接成全长rE1基因并克隆入pET32a构建成载体pET32-RV rE1,PCR、酶切和测序鉴定结果表明,合成的E1基因大小、序列与预期相符;构建获得重组质粒pET32-RV rE1.结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因并构建其重组质粒pET32-RV rE1.     

AgNO3和低温处理对小麦细胞GST及GR酶活性的影响

研究了AgNO3和低温处理对小麦悬浮细胞谷胱甘肽转移酶(GST)及谷胱甘肽还原酶(GR)酶活性的影响.结果表明,AgNO3和低温处理对小麦细胞再生的影响因处理时间的不同而有差异,在处理的4 d内低温处理使再生率明显增加,AgNO3处理2 d使细胞再生率显著增高,但处理4 d则对细胞再生无明显影响.低温处理使细胞蛋白质含量明显升高,AgNO3处理对小麦细胞蛋白质含量无明显影响.小麦细胞GST活性随处理时间的延长而迅速降低,AgNO3处理对GST活性无明显影响,但低温处理明显延缓GST活性降低.AgNO3和低温处理都使小麦细胞GR酶活性明显降低.AgNO3处理2 d和低温处理对细胞谷胱甘肽(GSH)含量无明显影响,但在处理的第4 d AgNO3使细胞GSH含量明显降低.     

抗草甘膦转基因大豆对雄鼠睾丸的影响

以雄性昆明小鼠为动物模型,分别以抗草甘膦转基因大豆和非转基因大豆饲料喂食,于30、90 d后,取其睾丸.采用流式细胞术检测睾丸组织中各生殖周期细胞比例、Hoechst33258染色观察睾丸细胞凋亡、组织化学染色技术观察睾丸组织病理学变化.研究抗草甘膦转基因大豆对雄鼠睾丸的影响.结果显示,30、90 d实验组和对照组小鼠睾丸精细胞单倍体、2倍体、4倍体比例均正常且趋于稳定,单倍体比例占主导地位,且实验组与对照组相比无统计学差异.在荧光显微镜下实验组睾丸细胞的细胞核呈正常的蓝色,与对照组相比,未发现明显的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,颜色有些发白的凋亡细胞.组织病理观察也未发现两组小鼠的睾丸出现明显病理损伤.30 d喂食抗草甘膦转基因大豆急性毒理研究和90 d喂食抗草甘膦转基因大豆亚慢性毒理研究对雄鼠睾丸均无显著影响.     

重组质粒pPIC9K-pZP3α-hCGβ CTP109～145的构建

目的：为发展多特异性避孕疫苗,制备重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,用基因工程技术构建重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,方法：根据pZP3α全长和hCG 0633CTP109-145编码的DNA序列设计两对引物,通过部分重聚合酶链式反应（overlaping PCR）,扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145片断,克隆到载体质粒pPIC9K中,然后导入大肠杆菌DH5α,用PCR和双酶切反应鉴定重组质粒,并用DNA测序仪对重组质粒测序,结果：3步PCR扩增出pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145DNA片段,插入到载体质粒pPIC9K的克隆位点,获得重组pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145表达质粒,测序结果显示插入序列与设计预期完全一致。结论：重组质粒pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145构建成功,为表达重组抗原pPIC9K－pZP3α－hCGβCTP^109-145,探讨重组多特异性避孕疫苗抗生育效能的研究建立基础。     

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG -pPIC9K的嗜甲醇酵母     

花生种子贮藏蛋白发育和萌发过程中17.5×103多肽的合成降解规律

目的 :分析花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白Ⅱ及其组成多肽的氨基酸组成 ,筛选高甲硫氨酸多肽并研究其在花生种子发育和萌发过程中的合成降解规律 方法 :花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ经SephadexG - 10 0纯化后 ,再以制备电泳和电泳洗脱得到高纯度的 5种多肽 ;酸水解法测定了花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ以及 5种多肽的氨基酸组成 ;WesternBlot分析了种子发育和萌发过程中 17 5× 10 3多肽的合成降解规律 结果 :花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ以及 5种多肽均含有 17种氨基酸 (包括 8种必需氨基酸 ) ,其中天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量为最高 ,约为总量的 4 5% ;而甲硫氨酸含量水平都极低 在这 5种多肽中 ,17 5× 10 3多肽的甲硫氨酸含量最高 17 5× 10 3多肽在花生种子发育早期开始合成 ,而在种子吸涨 60h时发生降解 结论 :17 5× 10 3多肽的甲硫氨酸含量最高 ,在花生种子发育和萌发过程中它的合成降解规律与花生球蛋白和伴花生球蛋白Ⅰ不同     

广东分离株HPV16型L2与重组E7融合蛋白原核表达载体的构建

分析广东分离株HPV16型的L2和E7基因结构,并对E7的4个功能区重新排列组合形成失去致癌作用但其抗原表位不改变,其命名为rE7,构建pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2 4个原核表达质粒.采用PCR技术从广东分离株HPV16基因组中扩增L2基因;用重叠PCR技术人工合成rE7基因和L2-rE7、rE7-L2融合基因,并构建到原核表达载体pET-28a(+)上. 成功扩增广东分离株HPV16型 L2基因,经重叠PCR技术成功得到rE7、L2-rE7和rE7-L2基因并成功构建了原核表达的4个载体:pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2. 广东分离株HPV16型L2基因与中国标准株有9处不同,同源性为99.37%,其编码氨基酸序列有8处突变. 成功合成失去致癌作用的基因rE7及构建4个原核表达载体.     

花生种子贮藏蛋白发育和萌发过程中17.5＊1 …

目的：分析花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白Ⅱ及其组成多肽的氨基酸组成,筛选高甲硫氨酸多肽并研究其在花生种子发育和萌发过程中的合成降解规律。方法：花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００纯化后,再以制备电泳和电泳洗脱得到高纯度的５种多肽;酸水解法测定了花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ以及５种多肽的氨基酸组成;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析了种子发育和萌发过程中１７．５＊１０＾３多