人白介素-2重组基因的T载体和pET28a表达载体的构建

从人单核细胞中提取总RNA,利用RT－PCR方法构建cDNA—mRNA杂交链,然后用人白介素－2基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定．鉴定正确后用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确．结果表明,插入列T载体和pET28a载体中的序列为402 bp的不带信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的IL-2序列相一致,故从人单核细胞中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人IL-2基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

风疹病毒E1抗原基因片段的拼接及原核表达

应用基因克隆技术,对风疹病毒E1抗原基因片段进行拼接及克隆表达．根据软件GOLDKEY预测E1抗原的主要抗原决定簇位点E1(243～286aa),再设计4条近60个碱基长引物,利用PCR仪延伸合成目的基因,酶切并构建重组表达载体,酶切与测序鉴定,再转化表达菌株BL21(pLYS),IPTG诱导表达,行SDS-PAGE检测到目的基因表达成功．结果实现了用基因克隆技术将含E1(243～286)片段的pETKDO载体向大肠杆菌的转化,IPTG诱导2h,获得的表达量高。     

EDSV六邻体蛋白基因克隆与原核表达载体构建

应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT-18载体上，经酶切、PCR鉴定及测序结果表明插入的片段为目的基因，全长2．733kb，共编码910个氨基酸。切下该目的基因定向克隆至pET-28a质粒构建了六邻体蛋白基因原核表达载体pET28a-hexon，经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序后证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误，从而为下一步的表达及进一步阐明EDSV六邻体蛋白基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好基础。     

谷子乙酰辅酶A羧化酶BC功能域的克隆及原核表达载体的构建

根据已知的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)序列设计合成了1对引物,对ACCase基因的BC功能域进行扩增,所得产物与预期片段大小一致,约1.8kb。该片段与克隆载体PGEM TEase连接,转入感受态大肠杆菌DH5а中增殖。提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆与原核表达载体PQE30分别用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后回收目的片段进行连接,并转入感受态大肠杆菌M15中,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。     

牛病毒性腹泻病毒牦牛株E0基因生物信息学分析及原核表达与抗原性检测

为研究牦牛BVDV E0蛋白的生物信息学及抗原性, 本研究对本实验室克隆并测序的牦牛病毒性腹泻病毒E0基因进行了生物信息学分析;同时用含有酶切位点、起始密码子、终止密码子的引物重新扩增E0基因, 并连接PMD18-T载体, 经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后, 将获得的E0片段克隆至PET-28A原核表达载体, 构建重组质粒并转入JM109.酶切、质粒PCR鉴定正确后转入rosetta(DE3)菌进行诱导表达.经SDS-PAGE检测结果显示目的基因获得了较高的表达, 表达的融合蛋白约33ku, 经western-blotting检测表明目的蛋白具良好的有抗原性.     

禽类多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突变体构建

为进一步研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译调控的分子机制,设计和构建了与野生型病毒APV-1相同的在AUG位点有agno-1a突变区和7个插入氨基酸的新型重组病毒.用碱裂解法提取了APV-1 cDNA克隆pHL1003,全长线性目的片段由Acc I部分酶切后回收,再用T4连接酶将合成的agno插入片段磷酸化后与目的片段连接得到了重组质粒,最后转化至E.coli DH10b感受态细胞中筛选阳性克隆.经PCR,PAGE和DNA测序验证获得了APV-1突变cDNA克隆.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因-迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersentivity antigen 1，DHA1)与小鼠共刺激分子B7-1的嵌合重组质粒。方法设计合成两对寡核苷酸引物。用PCR法分别从pUCmB7-1TM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7-1和DHA1的基因片段(921和984bp)。分别用HindⅢ、EeoRⅠ、XbaⅠ酶切后。逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌DH-5α．分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与献报道序列及预计结果一致。证实符合表达框架。结论本实验成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1。为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

辽阳职业技术学院高尔夫学院发展现状研究

采用问卷调查法、文献资料法、数理统计法对辽阳职业技术学院二级分院高尔夫学院成立三年来招生、专业设置、教师队伍与实习实训等现状进行深入调查与分析,结果表明:在招生方面,高尔夫学院目前还未能得到家长的充分认可,招生人数不多;专业设置单一,实践教学及社会服务能力薄弱;实习实训条件较好,但仍需进一步完善;教师队伍建设相对滞后.针对上述情况,给出促进高尔夫学院稳步发展的建议.     

关于一维非自治时滞系统点态退化的例子

给出了一维非自治时滞系统点态退化的几个例子。     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

“真空的真空”的存在性问题

许多科学家包括诺贝尔奖获得者李政道教授都预言,真空是未来物理学的一个重要研究对象.十七世纪的伽利略时代人们曾讨论过"真空"是否存在的问题.当时的学术界分成两派,一派以帕斯卡为代表,认为真空存在,另一派以笛卡尔为代表,认为真空不存在,最后实验证明"真空存在派"正确.现代研究表明,真空并非一无所有,这样就产生了一个新的问题"排除了真空物质后的空间",即"真空的真空"是否存在.本文探讨了与"真真空"有关的问题,提出了一些观测实验方法,这些方法可以帮助我们最终解答"真真空"的存在性问题.     

发动机转动惯量的实验测定

发动机转动惯量是发动机系统动态模型的一个重要参数,一般需要通过试验测取发动机转速衰减曲线,再由曲线拟合而得。在文中提出一种试验曲线的全程拟合法,比以往的标定转速点拟合法可以取得更高的精度。     

人-自观念演进的否定之否定

在人与自然界的关系的演进过程中,形成了与不同文明时期相适应的人-自观念。从＂天人合一＂到＂人定胜天＂再到＂和谐共生＂,这是人-自观念演进的肯定、否定、否定之否定的辩证发展过程,也是一个合乎规律的过程,它们都是时代的产物,都包含着不同程度的合理的因素,我们必须对它们进行具体的辩证的分析。     

老年人生活空间移动性影响要素研究进展

 老年人生活空间移动性是老年人在日常生活中能动生活状态的重要表征。在梳理老年人生活空间移动性相关概念、测度方法基础上，分析了物质环境要素和非物质环境要素对老年人生活空间移动性的影响；提炼出有效支持老年人生活空间移动性的中观环境规划、微观环境设计和政策文化扶助层面的策略；指出了老年人生活空间移动性的研究建议和发展方向。     

行政机关违法设定许可的法律责任探析

对于行政许可违法的法律责任问题，人们往往是从行政许可实施违法的角度进行研究，而对于设定违法及其责任追究的探讨却相对薄弱。然而。行政许可设定一旦违法，其对相对人和社会公共利益的损害将会更大，因此，对许可设定的违法及其责任问题进行研究，以避免违法行政行为的发生，促进政府依法行政，不仅必要而且是非常有意义的。     

曲面"侧"概念的"参照物"理解法

曲面“侧”是一个重要而难以理解的概念,本文对曲面“侧”概念的讲授方法进行了探讨,给出了曲面“侧”概念的“参照物”理解法,通过实践证明,效果良好。