抗菌肽SMAP-29在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母密码子偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,克隆到表达载体pPIC3.5K上,SalI线性化后转化毕赤酵母GS115,418抗性筛选高拷贝克隆,再由酵母菌落PCR鉴定;阳性克隆用甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导第2d的酵母裂解液中检测到与预期的SMAP-29分子量接近,约3.2kD的诱导表达带;Trizol法提取酵母总RNA,并通过RT-PCR扩增SMAP-29mRNA,发现表达期的酵母细胞中存在SMAP-29mRNA,而对照没有检出,表明SMAP-29在毕赤酵母中存在表达。     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达．利用PCR技术从YEpFLAG-1-DsRFP扩增出DsRFP编码序列．克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3．5K构建重组表达载体pPIC3．5K-DsRFP．电击转化进毕赤酵母．G418-RDB平板双重筛选后获得重组转化子．经MM／MD平板培养与PCR鉴定．重组子全部为HIS^ -MUT^ 表型．重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达．摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12％．表达量达到1．8g／L．经硫酸铵分级沉淀，DE-AE-5PW阴离子交换柱层析与S-HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白．说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力。     

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG -pPIC9K的嗜甲醇酵母     

大鼠组织型金属蛋白酶抑制剂-1在毕赤酵母中的重组表达

提取SD大鼠肝组织总RNA,通过RT-PCR扩增TIMP-1 cDNA片段.将扩增产物克隆至pUCm-T载体上,PCR、限制性酶切及测序证实后,EcoRI和NotI双酶切pUCm-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,并将阳性克隆进行PCR、酶切和测序分析,构建pPIC9K-TIMP-1表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,为进一步研究TIMP-1功能和作用机理等的研究创造了条件.     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

人防御素HNP4在毕赤酵母中的表达

为了构建人防御素HNP4重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K-HNP4,建立高效、稳定表达人防御素HNP4的毕赤酵母表达菌株,并对表达产物进行检测与分析.利用PCR技术从pUC18-HNP4上扩增人防御素HNP4,构建人防御素HNP4重组表达载体pPIC9K-HNP4.SacI线性化后电击法转化入毕赤酵母GS115中,再通过同源重组到酵母染色体上,用G418筛选高表达菌株,在三角摇瓶中0.5%甲醇诱导表达.SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,用标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌株混菌板鉴定活性.结果显示,SDS-PAGE和Western-blotting可检测到大小4.0 kDa左右的目的蛋白条带,表达量可达到500 mg/L,表达的重组人防御素HNP4具有较强的杀菌或抑菌活性.提示成功构建人防御素HNP4重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-HNP4,并建立高效、稳定表达有明显抗菌活性的重组人防御素HNP4的毕赤酵母表达菌株.     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子，人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因，将其克隆于M13载体中，DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因，将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-hFTH，电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带，与报道的hFTH的相对分子质量相近；酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。     

家蝇防御素defensin cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

提取家蝇总RNA,RT-PCR扩增编码家蝇防御素defensin的cDNA,克隆并测定了其序列,将该cDNA序列与酵母表达载体pPICZαA重组,构建酵母分泌型表达载体pPICZα-de,电激法转化毕赤酵母(Pichia pasto-ris)受体菌GS115。经表型筛选和PCR鉴定证明目的片段已稳定整合到酵母染色体基因组中。在含不同浓度的Zeoc in平板上筛选到高拷贝整合的转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达,用Tric ine-SDS-PAGE确定了表达产物的正确性,琼脂孔穴平板扩散法、比浊法测定了表达产物的活性,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定的杀菌活性。     

重组人Endostatin在甲醇酵母Pichia Pastoris中的分泌表达

为了获得高效表达分泌型重组人Endostatin菌株 ,利用基因工程技术 ,将目的基因连接到Pichia表达载体 pPIC9K中 ,将该重组质粒转入GS115菌株后筛选His阳性菌株 ,并用G4 18筛选高拷贝阳性克隆菌 .重组表达的Endostatin经SDS PAGE电泳 ,可在分子量 2 2kD处见到单一目标带 .经体外生物学活性检测 ,Pichia菌株表达的Endostatin能有效地抑制培养的ECV30 4细胞及P6 1细胞的生长 .     

人血管抑制素基因克隆、表达和生物活性分析

应用PCR技术从人胎肝cDNA库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GSll5，经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GSll5(pPIC8KA3)。再用G418筛选法，在含不同浓度的G418平板上筛选高拷贝整合的转化子。对高拷贝整合的转化子进行发酵培养和诱导表达。SDS—PAGE及Westem印迹分析显示：表达产物约占胞外蛋白的43％，相当于94mg/L，并具有免疫活性。并能抑制bFGF诱导的鸡胚尿囊膜新生血管的生成。还对用G418筛选高拷贝整合转化子的方法做了探索。     

Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

进行了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中实现了胞外表达。以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306染色体DNA为模板,通过PCR技术克隆了r-PA基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上并进行了序列测定。测序结果表明:克隆到的基因序列长1.1 kb,与已发表的Reteplase基因同源性达99.91%,其编码的氨基酸顺序一致。文中还构建了甲醇毕赤酵母分泌性表达载体pMETαA-r-PA,用PacⅠ单酶切将pMETαA-r-PA线性化后,采用电转化的方法将其导入甲醇毕赤酵母PMAD16中,PCR和表型鉴定表明,筛选到Reteplase基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上的阳性克隆。经摇瓶初步培养及以甲醇为唯一碳源诱导表达,胞外Reteplase表达水平最高达27.93mol/(s.L)。