噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

凡纳滨对虾T7噬菌体cDNA展示文库的构建

以来源于多种组织的mRNA为模板,构建了一个凡纳滨对虾混合组织的T7噬菌体c DNA展示文库。结果表明:噬菌体文库容量大,达9.3×10~7pfu;文库重组率高,为97%;大于250 bp的片段占70%以上;利用液体扩增法对文库进行扩增,扩增后文库的滴度为2.1×10~(12)pfu/m L。     

抗口蹄疫病毒phage-scFv及可溶性scFv的构建

利用重组DNA技术在抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C 7 VH基因和VL基因之间导入一段连接肽[(G ly4Ser)3],采用重叠延伸拼接法,经聚合酶链反应(PCR)扩增获得scF v基因。将scF v基因克隆至噬菌粒pCANTAB 5E载体,转化E.coli TG 1,构建噬菌体抗体文库。用M 13KO 7辅助噬菌体挽救及固相口蹄疫病毒(FMDV)抗原对噬菌体抗体文库的三轮“吸附-洗脱-扩增”的淘洗,筛选出scFv阳性克隆。将阳性克隆转化E.coli BH 2151,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性scFv蛋白的表达。酶联免疫吸附实验(EL ISA)检测表明:scFv克隆表达的phage-scFv及可溶性scFv与FMDV亲和力高,特异性强。     

褐飞虱取食水稻幼苗cDNA文库的构建及筛选

以褐飞虱取食 3 2 h的水稻幼苗为材料构建了 c DNA文库 ,初始文库含 3 .2× 1 0 6 个克隆 ,重组率为 86%,取 1 .0× 1 0 6个克隆子扩增一次 ,收集到 80 m L滴度为 1 .2× 1 0 9pfu/ m L的扩增文库 .随机挑取 2 0个克隆以 T7和 M1 3 reverse为引物进行 PCR扩增 ,以鉴定插入片段的大小 ,结果发现多数片段的长度在 1～ 4.0Kb左右 ,少数片段在 4Kb以上 ,个别片段在 6Kb左右 .以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的 ESTBp Hi0 0 8为探针 ,筛选 c DNA文库 ,得到该基因的 c DNA全长     

堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建及鉴定

构建堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina)孢子化卵囊cDNA表达文库,以筛选其功能性基因.用TRI-ZOL Reagent试剂提取堆形艾美耳球虫总RNA,再用Oligo(dT)12-纤维素柱从总RNA中分离mRNA,以mRNA为模板,RT-PCR法反转录合成cDNA第一链,用LD-PCR法扩增合成双链cDNA,经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经SfiⅠ酶切的λTriplEx2载体按一定比例连接,经体外包装,建立堆形艾美耳球虫孢子化卵囊的噬菌体表达文库.随后测定文库容量为4.6×106pfu/mL,扩增文库的滴度为4.4×1010pfu/mL,重组率达到98%,插入片段大小为750~1 000 bp,并从扩增文库中扩增出了堆形艾美耳球虫巨噬细胞游走抑制因子基因片段.     

抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

T7噬菌体文库构建中载体制备及连接条件的优化

目的分离纯化T7噬菌体DNA并构建T7select10-3b载体.方法用酚和氯仿:异戊醇(24:1)提取得到T7噬菌体DNA.用EcoRI和HindIII对T7DNA进行双酶切 ,得到载体的左臂和右臂.最后通过试剂盒从琼脂糖凝胶中回收载体的左右臂,用紫外分光光度计测定其纯度.与外援片段连接后进行体外包装.结果构建得到T7select10-3b载体 ,载体的左右臂大小分别为19kb和16kb,并成功包装成噬菌体颗粒.结论本方法适合大量提取纯化T7DNA和T7select10-3b载体,得到的载体可用于构建cDNA文库等其它基因工程的操作.     

巴西橡胶树基因组文库的构建

用改良 CTAB 法提取巴西橡胶树幼嫩叶片总 DNA,通过限制性内切酶 Sau3A 不完全酶切,回收并纯化后得到15～23 kb 的 DNA 片段。以来源于λ噬菌体的 EMBL3为载体 DNA,用T_4DNA 连接酶将载体与 DNA 片段连接成为重组 DNA。经体外包装形成完整的噬菌体颗粒,转染受体菌E.coli LE392,在 LB 平板培养基上获得重组子的效率为1.1×10~6个/μg DNA,达到构建文库的要求。随机挑取一定数量的克隆子,酶切分析结果发现有88%的克隆子携带外源 DNA。     

轮状病毒VP7基因的克隆及核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了916bp的VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-V7中含有轮状病毒的VP7基因片段。经核苷酸序列分析，表明正确克服了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区。     

致弱Ⅰ型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)感染的细胞基因组DNA的EcoRⅠ酶切产物建于Puc18质粒载体文库中,以digoxingenin标记的含有强毒GA株MDV pp38基因克隆片段作为探针,进行原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用EcoRⅠ酶切分析筛选到含pp38基因同源物的重组Puc18质粒. 序列分析表明该pp38基因同源物与pp38基因有极高的同源性,仅有1个碱基突变并导致1个氨基酸的替换.     

大鼠20αHSD基因调控序列的克隆与检测

酶切包含20αHSD基因及其调控序列的X噬菌体13NA,获得4．0kb的DNA大片段,将此片段与载体质粒连接得到重组质粒,酶切重组质粒后电泳,再以地高辛标记的20αHSD基因的cDNA为探针进行Southern杂交,实验获得了大片段的重组质粒。     

禽类多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突变体构建

为进一步研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译调控的分子机制,设计和构建了与野生型病毒APV-1相同的在AUG位点有agno-1a突变区和7个插入氨基酸的新型重组病毒.用碱裂解法提取了APV-1 cDNA克隆pHL1003,全长线性目的片段由Acc I部分酶切后回收,再用T4连接酶将合成的agno插入片段磷酸化后与目的片段连接得到了重组质粒,最后转化至E.coli DH10b感受态细胞中筛选阳性克隆.经PCR,PAGE和DNA测序验证获得了APV-1突变cDNA克隆.     

极端嗜热厌氧纤维素分解菌基因文库的构建及其内切葡聚糖酶基因片段的克隆

以从云南邦拿掌温泉中分离、纯化的高温厌氧纤维素分解菌邦2菌(Cadicellulosiruptor)为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经EcoRⅠ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因文库,经筛选鉴定得到6.3×103个重组子;重组子经刚果红平板验证:约有23.5%菌落呈现透明圈;重组子经EcoRⅠ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段.结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的内切葡聚糖酶基因(ED基因)片段.     

噬菌体筛选技术筛选与联萘酚(BINOL)相结合的抗体

利用噬菌体展示技术筛选只结合1种对应体的BINOL抗体,建立人类单链抗体(scFv)噬菌体文库--Griffin.1文库,以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.从经过4轮富集的次级抗体库中挑选到噬菌体克隆,用该克隆制备的单链抗体阳性克隆,经ELISA证实具有良好的抗原特异性.从人类scFv噬菌体文库中获得抗BINOL的特异性抗体.     

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选

利用噬菌体展示技术进行纳米抗体库的构建和筛选,获得抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,为相关癌症诊断及靶向治疗的应用奠定基础。使用重组CEACAM5抗原免疫羊驼,分离免疫后羊驼的外周血淋巴细胞,提取总RNA后通过RT-PCR技术扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段,构建纳米抗体文库。采用噬菌体展示技术和固相淘选方法,筛选得到强阳性克隆,经大肠杆菌表达和镍离子亲和层析获得纳米抗体,最终利用Biacore分析其亲和力和特异性。通过3轮的淘选,获得一株纳米抗体亲和力达到2.6×10-10mol·L-1,对同源性蛋白CEACAM-1、-3、-6、-8及肿瘤蛋白AFP均无交叉反应性。利用噬菌体展示技术成功获得了抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,可用于后续相关癌症诊断和靶向治疗。     

EL-4荷瘤鼠单链噬菌体抗体库的构建

目的:构建一个EL-4荷瘤鼠的单链噬菌体抗体库,为筛选高特异性和高亲和力的单链抗体做准备.方法:于C57小鼠腋区接种EL-4细胞,待肿瘤长大后,从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR技术扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因(VH、VL),用Linker奖VH和VL基因连成单链抗体可变区片段(scFv).双酶切后(Not Ⅰ、Sfi Ⅰ)与预备好的pCANTAB5E噬粒载体连接,转化入感受态TG1,构建EL-4荷瘤鼠的单链噬茵体抗体库.随机抽取转化后的20个克隆,用以检测外源DNA的转入情况.结果:PCR扩增出的VH约有340bp和VL约有320bp,scFv的长度约有750bp.转化后的TG1约有1.67×107个茵落,随机挑取20个克隆,双酶切显示五分之一的茵落转化了外源DNA片段,有效库容为3.34×106.结论:成功构建了EL-4荷瘤鼠的单链噬茵体抗体库.     

棉花腺体形成时均一化cDNA文库的构建

为克隆筛选棉花腺体形成相关的基因，运用SMART技术构建cDNA文库.首先抽提棉花腺体形成时期的mRNA，mRNA逆转录后合成cDNA，经均一化处理后，SfiⅠ酶切，连接质粒载体，电转化，成功构建了棉花腺体形成时期的cDNA文库.经鉴定原始文库滴度为5.8×105 cfu/mL，其重组率高达94%，插入片段的平均长度约为1.4 kb.     

HL—60细胞系基因组文库的构建

从培养的HL-60细胞中提取出高分子量的基因组DNA,以EcoRⅠ部分酶解,蔗糖密度梯度离心得到15～30kb的插入片段。以PEG8000沉淀,CsCl密度梯度离心提纯EMBL4噬菌体DNA,以EcoRⅠ,EamHⅠ双酶解得到左右臂,连接、包装得到9.7×10~5个重组体.随机检测了4个重组体,其插入片段平均为19kb.对于19kb的插入段,特定DNA序列达到99％检出率所需的重组体为7.3×10~5(Pfu).