金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的克隆及其序列特征分析

根据酸性海藻糖酶的蛋白质序列设计引物,PCR扩增出CQMa102 ATM1的cDNA和DNA序列,登录号分别为:DQ237957,EF190950.序列分析表明,ATM1 DNA序列含有3个内含子,其开放阅读框(ORF)编码1个含1 073个氨基酸的蛋白质,具有1个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr).NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillus fumigatus的alpha、alpha-trehalose glucohydrolase,Aspergillus nidulans的酸性海藻糖酶前体和Talaromyces emrsonii的酸性海藻糖酶分别有62%、59%和57%的氨基酸相似性,与另外两个真菌Saccharomyces cerevisiae(Ath1p)和Candida albi-cans(Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25%的氨基酸相似性.Southern杂交表明,ATM1基因在CQMa102基因组中为单拷贝.     

绿僵菌NTL基因上游调控序列的克隆及分析

实验室已经克隆了金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因（NTL）的编码序列（GenBank登录号：AY557612）,为了解该基因的上游调控信息,采用Panhandle Polymerase Chain Reaction Amplification方法获得了长为982bp的中性海藻糖酶基因上游序列.序列分析表明,该序列含有5个CAAT启动子元件和一个压力反应元件（CCCCT）.经PCR和Southern杂交验证表明,利用panhandle PCR法成功地获得了金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因上游序列,并且该基因在金龟子绿僵菌基因组中以单拷贝形式存在.     

从寄主昆虫血淋巴中分离纯化病原真菌菌体的方法

采用正交实验方法，对东亚飞蝗（Locusta migratoria）血细胞裂解及其DNA和RNA降解的条件进行了优化．在优化条件下，不仅去除了感病东亚飞蝗血淋巴中的血细胞及DNA和RNA。而且成功地分离和纯化了绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌体．裂解血细胞及其DNA和RNA的最佳酶解条件为：蛋白酶K的浓度为1mg／mL，作用温度为26℃，时间为60min，脱氧核糖核酸酶（DNAase I）的用量为5U，核糖核酸酶（RNAaseA）的浓度为0．5mg／mL，作用时间为35min，作用温度为30℃．以蝗虫特异引物进行PCR及RT-PCR检测结果表明，从绿僵菌侵染后的蝗虫血淋巴中分离纯化无蝗虫DNA和RNA污染的绿僵菌菌体，为后续分离和克隆绿僵菌侵入蝗虫体内后表达的基因，研究它们在致病机理中的作用奠定了基础．     

贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群的分析

贡嘎蝠蛾(Hepialus gonggaensis)幼虫是名贵中药材冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的优势寄主.研究贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群,对研究蝠蛾的营养生理,提高幼虫成活率,进而人工培殖冬虫夏草具有重要意义.实验以四川康定采集的贡嘎蝠蛾为实验材料,对贡嘎蝠蛾幼虫的肠道细菌进行了分离和鉴定.实验结果表明,贡嘎蝠蛾肠道细菌都属低温菌,最适生长温度15 ℃,在15 ℃培养2 d后才长出典型菌落.从肠道中分离纯化出12个不同菌群,其中优势菌群为葡萄球菌,菌群数量为2.05×109 mL-1,检出率100%,应为幼虫肠道中的常住菌群,其它菌群检出率均低于50%,可能为肠道中的过路菌群.生化鉴定大多数菌群的符合值都较低,这与蝠蛾生活于高海拔高寒地区,其肠道微生物与常见微生物菌群有较大差异一致.     

理化因子对白僵菌附着胞形成的影响

研究了2种营养液、3种化学诱导物、6种基物以及微生态条件对球孢白僵菌分生孢子萌发和附着胞形成的影响.结果表明:白僵菌分生孢子在0.01%YEM、1%1/4SDY培养基中附着胞形成率最高.在1×106 ～5×106 mL-1的孢子浓度下,接种4 mL 0.01%YEM,同时在(26±1) ℃、pH7.0、先黑暗后光照培养条件下最有利于附着胞形成.不饱和脂肪酸对附着胞的形成有诱导作用或抑制作用.基物的表面结构、疏水性以及硬度与附着胞的形成有关.     

棉花腺体形成时均一化cDNA文库的构建

为克隆筛选棉花腺体形成相关的基因，运用SMART技术构建cDNA文库.首先抽提棉花腺体形成时期的mRNA，mRNA逆转录后合成cDNA，经均一化处理后，SfiⅠ酶切，连接质粒载体，电转化，成功构建了棉花腺体形成时期的cDNA文库.经鉴定原始文库滴度为5.8×105 cfu/mL，其重组率高达94%，插入片段的平均长度约为1.4 kb.     

除虫菊酯人工抗原的合成及鉴定

通过在除虫菊酯6种单体的五元环酮基上引入羧基的方法制备半抗原,再用碳二亚胺法偶联到牛血清白蛋白(BSA)上制得完全抗原.经紫外光谱测定,6种完全抗原的分子偶联比为6:1(除虫菊酯Ⅰ:BSA)、13:1(除虫菊酯Ⅱ:BSA)、9:1(瓜叶菊酯Ⅰ:BSA)、11:1(瓜叶菊酯Ⅱ:BSA)、7:1(茉酮菊酯Ⅰ:BSA)和9:1(茉酮菊酯Ⅱ:BSA).以完全抗原免疫BALB/c小鼠制抗血清,采用间接酶联检测抗体效价均达到105以上,再用饱和硫酸铵沉淀得到除虫菊酯的多克隆抗体.该结果为除虫菊酯的酶联抗体检测及免疫分析技术奠定了基础.