致弱Ⅰ型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)感染的细胞基因组DNA的EcoRⅠ酶切产物建于Puc18质粒载体文库中,以digoxingenin标记的含有强毒GA株MDV pp38基因克隆片段作为探针,进行原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用EcoRⅠ酶切分析筛选到含pp38基因同源物的重组Puc18质粒. 序列分析表明该pp38基因同源物与pp38基因有极高的同源性,仅有1个碱基突变并导致1个氨基酸的替换.     

Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,设计合成Egr-1基因shRNA片段,连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuro~(TM)shRNA真核表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养,经菌液PCR法初步鉴定为pGreenPuro-Egr-1shRNA重组子的重组子DNA,用测序法进一步鉴定,结果显示成功构建了Egr-1基因shRNA的反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1shRNA.     

重组质粒pPAHD1的限制性内切酶图谱分析

本文对我们构建的含有青霉素酰化酶(Acylace)基因的重组质粒pPAHD1进行了限制性内切酶图谱的测绘。使用了限制酶14种,证明BglⅡ,SalⅠ,SmaⅠ和BamHⅠ在重组质粒上各有切点一个;EcoRⅠ有切点两个:HindlⅡ,AvaⅠ各有切点三个;PvuⅠ有切点四个;EcoRⅤ和XmnⅠ各有切点五个。     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长cDNA克隆pB_aS_1C184经Bgl Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,回收其中的酪蛋白基因编码片段,与经BamH Ⅰ、SmaⅠ双酶切的植物表达载体pBI121.2分两步连接:第一步载体的BamHⅠ末端与酪蛋白基因的BglⅠ粘性末端连接;第二步用T_4DNA多聚酶补平酪蛋白基因的EcoR Ⅰ末端,再与载体SmaⅠ进行平末端连接而环化,转化JM109菌株,从得到的33个转化子中,通过~(32)P标记的酪蛋白cDNA基因为探针,点杂交筛选到一个阳性克隆。经酶切鉴定,确认酪蛋白cDNA基因编码区已正确插入到pBI121.2中。     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

一种新型基因枪的研究

为研制一种适应各种场合 ,尤其是在野外操作的基因枪 ,满足将目的基因导入动植物细胞 ,使之稳定表达并遗传 ,实现培育或改良新的优良品种。以压缩弹簧为动力 ,运用撞击发射原理 ,对裹着基因的微粒进行加速 ,使之获得足够的动能 ,去射击靶细胞。弹簧预压力不同 ,微弹的动能随之不同 ,可适应不同细胞的要求。利用所设计的装置 ,在常压下将GUS基因导入番茄叶片细胞 ,经检测 ,得到表达 ;将质粒psv- luc2 0转入小鼠的皮肤、腹部肌肉和肝脏内 ,也得到表达。实验表明 ,该构思是可行的 ,实验装置可以在常压下操作 ,能在各种条件下使用     

GCK2软件在p53基因克隆过程中的应用

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的押癌基因，通过克隆p53基因对其表达调控进行研究。利用分子生物学软件GCK2．0对整个克隆过程进行分析，制定克隆策略，通过测序鉴定结果，得到了舍目的基因p53cDNA全序列的pTRE—p53重组质粒。通过GCK2．0分析，减少了基因克隆的盲目性，提高了工作效率。     

GCK2软件在p53基因克隆过程中的应用

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，通过克隆p53基因对其表达调控进行研究。利用 分子生物学软件GCK2.0对整个克隆过程进行分析，制定克隆策略，通过测序鉴定结果，得到了含目的基因 p53cDNA全序列的pTRE-p53重组质粒,通过GCK2.0分析,减少了基因克隆的盲目性,提高了工作效率。     

Progress of gene targeting in mouse

Gene targeting is a powerful approach of studying the gene function in vivo. Specific genetic modifications, including simple gene disruption, point mutations, large chromosomal deletions and rearrangements, targeted incorporation of foreign genes, could be introduced into the mouse genome by gene targeting. Recent studies make it possible to do the gene targeting with temporal and spatial control.     

穿俊质粒pGFP—1与CMV启动子重组体的构建

构建并筛选出能在哺乳细胞表达的重组质粒。方法：以含ＧＦＰｃＤＮＡ报告者基因的穿梭质粒ｐＧＦＰ－１ｏ ｆａ ｗｓｇ ，ｔｆｑｐｅｔ ｗ ａｎｄ ｘｌｅｑｕｇｇｘｙｎｋ ｆｃｌ ｂｂ ，ｅｓ ｅｔ ａｄｌｄｔｇｊ ｘｅｇ ｒｆｓｙｓｑ ｖｆｈｐｔｇｊ ｘｅｇ ｒｆｍ ｏｕｇ     

柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。     

过表达小鼠ERA蛋白对细胞系的影响

为了研究鼠ERA蛋白对细胞生长状态的影响,构建了可调控诱导表达载体pEGSH-mera,并与受体表达载体pERV3稳定共转染鼠成纤维细胞L-929。应用PonA进行诱导表达后,Western Blot检测其表达水平发现,细胞中鼠ERA蛋白明显增多;用MTT法测定其生长曲线发现,细胞生长加快;应用流式细胞仪检测其细胞周期发现,G2/M期细胞数量明显减少。所以,鼠ERA蛋白在细胞周期中发挥重要作用。     

牛结核分支杆菌临床分离株rpsL，rpoB，KatG基因突变分析

采用噬菌体生物扩增法对本实验室分离鉴定的25株奶牛结核分支杆菌进行药敏分析,检测出14株耐链霉素、利福平、异烟肼菌株．用PCR扩增耐药株的rpsL基因片段（370bp）、rpoB基因片段（213bp）和KatG基因片段（458bp）,并对目的片段进行测序分析,其中5株耐链霉素菌株的rpsL基因在43位点发生突变,均由赖氨酸密码子（AAG）突变为精氨酸密码子（AGG）;5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点、526位点、5¨位点发生突变,其中有3株分离株的rpoB基因在531位点发生点突变,1株分离株的rpoB基因在526位点发生突变,1株分离株的rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变．     

抗菌肽的研究及其在植物基因工程中的应用

抗菌肽是一类新型的抗菌物质,在低等生物到高等动植物有广泛分布．抗菌肽及人工合成的抗菌肽基因在植物体中可以被表达并具有杀菌活性,能够应用于植物抗病工程方面,从而提高植物的抗病性．本文简要介绍了抗菌肽的发现、分类、结构、作用机理、基因结构和基因改造,以及抗菌肽在植物基因工程中的应用．     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.