利用搭桥PCR法实现轮状病毒VP7表位片段的重组

选择了RV VP7的3个高度保守可诱发高水平体液免疫反应的中和性抗原表位，人工合成了这3个表位片段。采用了一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法-搭桥PCR法，方便快速地构建了轮状病毒VF7蛋白的重组表位基因，将其T／A克隆入PBS-T载体，经过测序与报道序列同源性达100％。结果表明：搭桥法PCR简单易行，快速准确，尤其是在构建2个或多个小基因片段的融合时，比酶切、连接方法更具优越性。     

新疆绵羊β-乳球蛋白(BLG)5′端调控区的克隆与序列测定

用聚合酶链式反应(PCR)技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段.通过T4 DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段.经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致.     

人A组轮状病毒结构蛋白VP7原核表达及其卵黄抗体效价的研究

为获得人A组轮状病毒重组结构蛋白VP7及其高效价的卵黄抗体,使用PCR技术扩增VP7 DNA片段并将其克隆到原核表达载体pET28a上形成重组质粒pET28a-VP7。将重组质粒转化基因工程菌E.Coil BL21(DE3),用0.5 mM IPTG诱导VP7重组蛋白的表达。通过包涵体纯化和蛋白复性后,将VP7重组蛋白与弗氏佐剂混匀免疫产蛋鸡,收集鸡蛋。用水稀释-盐析法纯化卵黄抗体IgY。进一步应用SDS-PAGE、ELISA和点杂交技术,分析该卵黄抗体的纯度、效价和特异性。结果表明在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中能够实现VP7重组抗原的表达,将重组抗原VP7免疫产蛋鸡,提取纯化得到滴度为1:100 000的抗VP7卵黄抗体,且特异性的识别野生型A组轮状病毒。     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆及其序列分析

从病变鸡法氏囊组织中分离纯化IBDV,提取其基因组RNA.以IBDVRNA为模板,进行反转录反应合成cDNA第1链.采用PCR技术扩增VP5基因.将PCR产物经酶切后与pcDNA3.1(+)载体连接,经转化、筛选得到重组质粒pIBDV-VP5.对VP5基因进行了测序并对其序列进行了分析.     

猪脑心肌炎病毒VR-129 B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。     

胰岛自身抗原GAD65片段和胰岛素B链基因共表达DNA疫苗的构建与表达

构建两种胰岛自身抗原谷氨酸脱羧酶（ glutamic acid decarboxylase, GAD） 65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗，并检测其在体外COS-7细胞中的表达。PCR方法从GAD65质粒中扩增出GAD190-385和GAD490-570两个片段的cDNA，overlap法再分别与信号肽基因进行拼接，将拼接后的融合基因SGAD190-515和SGAD490-570分别与胰岛素B链基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCFA．1中。重组质粒经酶切和测序鉴定后，脂质体体外转染COS-7细胞，Western blot方法检测目的基因在该细胞中的表达。结果表明核酸序列测定克隆的融合基因和胰岛素B链基因序列与报告序列一致，开放阅读框正确，Western blot显示转染了DNA疫苗的COS-7细胞中均可检测两个目的基因的表达。两种GAD65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗均成功构建，为自身免疫糖尿病的免疫干预研究奠定了实验基础。     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因的克隆及序列分析

根据U．Washington报导的根癌土壤农杆菌(Agribacterium tumefaciens)C58Ti质粒基因序列，设计1对引物，利用PCR的方法扩增了c58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因。通过琼脂糖凝胶电泳，所得E1的片段略小于500bp，与引物设计跨幅片段476bp相吻合。将此片段连接到T载体，经蓝白斑筛选、PCR鉴定、测序及DNA序列分析，结果表明：克隆VirD1基因编码序列与报导的序列同源性达100％，说明通过PCR方法获得的VirD1基因片段是正确的，为进一步研究该基因的表达和活性奠定了基础。     

检测微囊藻毒素合成酶基凶mcyH的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR方法的建立

利用RT—PCR方法从铜绿微囊藻PCC7806 mcy基因中扩增出目的基因片段，用TA克隆方法将基因片段插入pGEMT—T Easy中来制备质粒标准品．通过不同连续稀释倍数的质粒标准品成功构建了16srRNA和mcyH两基因的标准曲线，该法构建的两基因标准曲线r^2分别为0．9916和0．9938，且质粒标准品具有较好的重复性，满足实时荧光定量RT—PCR的要求．     

柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。     

Progress of gene targeting in mouse

Gene targeting is a powerful approach of studying the gene function in vivo. Specific genetic modifications, including simple gene disruption, point mutations, large chromosomal deletions and rearrangements, targeted incorporation of foreign genes, could be introduced into the mouse genome by gene targeting. Recent studies make it possible to do the gene targeting with temporal and spatial control.     

四种原发恶性肿瘤中p16基因的缺失和突变研究

采用双重PCR、PCR－SSCP和序列分析方法,对31例非小细胞肺癌、15例食管癌、12例胃癌、9例乳腺癌共68例原发肿瘤组织标p16进行在肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌的缺失率分别为16％（5／31）、,20－％（3／15）,8％（1／13）,0（0／9）,2例突变：一例食管癌在第130位氨基酸密码由AGA变为ATA,编码的氨基酸由精氨酸变为异亮氨酸,一例肺癌第140位氨基酸的CGG处的C缺失,导致移码突变,p16基因在人类恶性肿瘤发生发展中起重要作用,是多肿瘤抑制基因。     

GCK2软件在p53基因克隆过程中的应用

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的押癌基因，通过克隆p53基因对其表达调控进行研究。利用分子生物学软件GCK2．0对整个克隆过程进行分析，制定克隆策略，通过测序鉴定结果，得到了舍目的基因p53cDNA全序列的pTRE—p53重组质粒。通过GCK2．0分析，减少了基因克隆的盲目性，提高了工作效率。     

GCK2软件在p53基因克隆过程中的应用

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，通过克隆p53基因对其表达调控进行研究。利用 分子生物学软件GCK2.0对整个克隆过程进行分析，制定克隆策略，通过测序鉴定结果，得到了含目的基因 p53cDNA全序列的pTRE-p53重组质粒,通过GCK2.0分析,减少了基因克隆的盲目性,提高了工作效率。     

一种新型基因枪的研究

为研制一种适应各种场合 ,尤其是在野外操作的基因枪 ,满足将目的基因导入动植物细胞 ,使之稳定表达并遗传 ,实现培育或改良新的优良品种。以压缩弹簧为动力 ,运用撞击发射原理 ,对裹着基因的微粒进行加速 ,使之获得足够的动能 ,去射击靶细胞。弹簧预压力不同 ,微弹的动能随之不同 ,可适应不同细胞的要求。利用所设计的装置 ,在常压下将GUS基因导入番茄叶片细胞 ,经检测 ,得到表达 ;将质粒psv- luc2 0转入小鼠的皮肤、腹部肌肉和肝脏内 ,也得到表达。实验表明 ,该构思是可行的 ,实验装置可以在常压下操作 ,能在各种条件下使用     

抗菌肽的研究及其在植物基因工程中的应用

抗菌肽是一类新型的抗菌物质,在低等生物到高等动植物有广泛分布．抗菌肽及人工合成的抗菌肽基因在植物体中可以被表达并具有杀菌活性,能够应用于植物抗病工程方面,从而提高植物的抗病性．本文简要介绍了抗菌肽的发现、分类、结构、作用机理、基因结构和基因改造,以及抗菌肽在植物基因工程中的应用．     

Inheritance and expression of multiple disease and insect resistance genes in transgenic rice

2—3 anti-fungal disease genes are coinserted with hygromycin phosphotransferase in the same vector. Two insecticidal genes and PPT acetyl transferase genes are placed in another one. The vectors are co-delivered to rice embryonic cellus tissue at a molar ratio of 1︰1 using the particle gun method. 55 independent regenerated lines have been obtained through screening for hygromycin resistance. Of these, 70% transgenic plants harbor 6—7 foreign genes. The genes on the same vectors are always co-delivered to rice plant. Northern blot analysis has indicated that the multiple foreign genes give stable expression. In the 6 transgenic plants carrying 6—7 foreign genes, multiple foreign genes tend to integrate in 1 or 2 genetic loci. Progeny segregation is consistent with Mendel’s 3︰1 segregation law. 8 homozygous R₁ transgenic plants harboring 2—3 anti-fungal and 2 insecticidal genes are selected from large number of transgenic progeny screening for hygromycin and Basta resistance.