定点突变提高豆豉纤溶酶的酶活力和底物特异性的研究

以pBE—DFE质粒为模板,采用反向长距离PCR技术对豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme,DFE)基因进行定点突变,使位于酶的底物结合区第156位的谷氨酸和第166位的甘氨酸分别替换为丝氨酸和丙氨酸,使临近酶的底物结合区的第169位甘氨酸残基替换为丙氨酸,获得了三个突变体E156S,G166A和G169A.将含突变基因的表达载体转化枯草杆菌WB800,构建了豆豉纤溶酶基因突变体的表达菌株WB800(E156S);WB800(G166A)和WB800(G166A).将3种表达菌株进行液体发酵培养,结果发现发酵上清液中纤溶酶的纤溶活性为460,790和900U/mL,分别是未突变酶活性(660U/mL)的70%,115%和136%;3种突变酶对合成底物的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的酰胺水解活性是未突变酶的17%,125%和121%.     

人纤溶酶原K1—3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原Krigle 1-3(K1-3)基因插入融合表达载体pET-17b，获得重组质粒pET-K13,转化E.coli BI21(DE3),在IPTG诱导下，人纤溶酶原K1－3基因在E.coli BI21(DE3,pET-K13)中获得高效融合表达，表达量占菌体总蛋白的24％，表达产物以包函体存在，Western blot证明重组 蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性。     

人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入融合基因表达载体pET17bBamHⅠ位点,构建成重组质粒pETK23,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,纤溶酶原kringle5功能区基因在重组转化菌株BL21(DE3,pETK23)中获得高效表达,表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白的528%.     

分泌载体pPSA18的构建及地衣杆菌淀粉酶在枯草杆菌中的表达和分泌

本文报道利用枯草杆菌噬菌体Spol 的启动子Spac Ⅰ,合成的解淀粉芽胞杆菌信号序列及枯草杆菌质粒PUB 18重组,构建分泌型表达载体并将地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因(缺失启动子及信号序列)引入构建的载体,获得重组质粒pPSA 18.将此质粒转化枯草杆菌QB1130(amy~-)感受态细胞,在含5μg/ml 卡那霉素及1%可溶性淀粉的LB 平板上筛选Km~r 及淀粉酶阳性的转化子.从阳性转化子中提取质粒,经酶切分析后重新转化枯草杆菌QB1130,得到的转化子全部都能向胞外分泌淀粉酶,证明构建的载体能在枯草杆菌中表达和分泌外源基因产物.     

分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化

通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断，将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPICgK／rPA，转化Pichia pastoris GS115宿主菌．通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His^ Mut^s表型转化子．并在2．0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10，GR11．摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白分子量约39ku，能与特异性单克隆抗体发生免疫反应；体外气泡法测定rPA活性，结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性．通过正交试验，优化发酵条件，表达活性最高为1050IU／mL．     

蚯蚓纤溶酶7#组分基因在甲醇酵母中的克隆与表达

为了使蚯蚓纤溶酶(EFE)最佳活性组分EFE-7#基因在甲醇酵母(Pichia pastoris)中获得表达,构建了表达载体pPIC9K-EFE,通过对电击条件的优化,转化率达到5×103个/μg DNA.为了便于筛选阳性克隆,以该基因的原核表达产物为抗原免疫动物,获得了与天然EFE-7#组分具有相同免疫特异性的抗体.用该抗体为探针对上述转化子进行筛选,得到了上百株阳性重组子.RT-PCR和western blotting证明,EFE-7#基因在这些重组子中获得了表达,表达产物相对分子质量高于天然产物.     

利用枯草杆菌整合表达嗜铬粒蛋白抗真菌片段

为实现CGA1-76片段基因在枯草杆菌中的稳定表达,将CGA1-76片段基因的表达元件重组到枯草杆菌转座子质粒pHV1249微转座子mini-Tn10内,利用mini-Tn10将CGA1-76片段基因的表达元件整合到枯草杆菌DB1342染色体上,用氯霉素和红霉素筛选枯草杆菌转座工程菌DB1342(TnSVTQ).DB1342(TnSVTQ)在无选择压力条件下经10 d连续传代培养,转座子内氯霉素抗性丢失率为0%,说明转座子稳定整合在DB1342染色体上.SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明,在蔗糖诱导下,CGA1-76片段基因在DB1342(TnSVTQ)中获得表达,产物被分泌到细胞外.孔穴琼脂扩散法测定表达上清的抑制真菌活性,结果表明重组CGA1-76能抑制烟曲霉菌和黄曲霉菌的生长,抑菌圈直径分别为9 mm和8 mm.     

枯草杆菌诱导型高效表达-分泌系统的构建

利用枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株,sacB诱导基因及degQ,degU(Hy)正调控基因构建了诱导型表达-分泌系统以解决枯草杆菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表达水平不高的问题.采用共转化方法将枯草杆菌IA95的degU(Hy)突变引入枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株DB403,获得degU(Hy)和蛋白酶三缺陷的新菌株DB1342;利用sacB基因的启动子--信号序列及芽孢杆菌的两个正调控基因degQ和degU(Hy)构建了诱导型表达-分泌载体pURT3及pURTQ4,由DB1342突变株及pURT3及pURTQ4载体组成枯草杆菌诱导型高效表达和分泌系统.在本系统中内源基因sacB的表达量是原菌株DB403的296倍,将地衣杆菌α-淀粉酶基因引入本系统后在sacB,degQ,degU的调控和蔗糖的诱导下,α-淀粉酶的表达量是在DB403中的140倍,证实degQ及degU对基因表达的增强作用是叠加的.     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2．1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a／K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌．经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％．该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性．     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

产纤溶酶菌株的分子鉴定及其液体产酶特点分析

通过对实验室分离筛选出的2株产纤溶酶能力较强的细菌菌株进行16S rRNA碱基序列测定,并与已发表的16S rRNA序列进行对比分析,确定2个菌株均属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).在此基础上,对2个菌株液体发酵产纤溶酶的特点进行了对比分析.实验结果表明,2个菌株适宜的发酵产酶时间均为60～108 h.在优化的液体发酵条件下,2个菌株单位发酵液中纤溶酶平均产量可分别达到773.07 U/mL(菌株1)和962.28 U/mL(菌株2).     

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化

为构建1株产中性蛋白酶的工程菌株并对其发酵条件进行优化,以中性蛋白酶工业生产菌株枯草芽孢杆菌AS1.398的基因组为模板,采用PCR技术扩增获得中性蛋白酶基因npr,与高拷贝质粒pWB980连接并转入蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB600中得到重组工程菌WB600/pWB980-npr.在初筛平板上工程菌蛋白酶活力明显高于工业生产菌AS1.398,工程菌发酵活力可达1,398.3,U/mL.通过对其发酵工艺进一步优化,在接种量5%、装液量100,mL/500,mL、摇床转速180,r/min、温度34,℃的条件下发酵48,h,发酵液的酶活力可达2,487.5,U/mL,比优化前提高了78%.     

丙烯酰CoA合成酶在大肠杆菌中的表达及其酶活性表征

以橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）dsm636基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆了丙烯酰CoA合成酶（ACS）基因,并连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建了pET-22b(+)-Acs重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+) Acs转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建了大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-Acs基因工程菌。重组菌株经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,目标条带出现在分子量约160000处,表明丙烯酰CoA合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达;体外酶活实验证明,所表达的丙烯酰CoA合成酶是具有活性的。     

重组葡萄糖脱氢酶的表达及辅酶再生应用研究

为解决异源表达酮还原酶域EryKR1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)催化环己酮还原时消耗的氢供体NADPH再生的问题,构建了克隆枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组菌E.coli BL21(pET28a-gdh),其中的gdh基因经Nucleotide BLAST功能分析显示与枯草芽孢杆菌9902的gdh基因序列(登录号为EF626962.1)的一致性达到100%。SDS-PAGE检测显示该重组菌经IPTG诱导后可以高效表达出葡萄糖脱氢酶(GDH),其表达量占全菌可溶性蛋白质的64%。GDH粗酶液的比酶活为137.90U/mg。通过气相色谱检测添加了E.coli BL21(pET28a-gdh)的E.coli BL21(pET28a-eryKR1)环己酮还原反应体系中的环己醇含量,结果显示加入重组GDH的双重组菌耦合反应体系中环己醇的产率为82.21%,是未添加GDH的反应体系对应值的3.23倍,表明重组GDH可以为EryKR1还原环己酮系统解决辅酶再生问题。     

ribR基因在产核黄素枯草芽胞杆菌中的组成型表达

枯草芽胞杆菌ribR基因编码单功能黄素激酶,催化核黄素转化为FMN.ribR基因作为ytmI-ytnM操纵子的一部分,其表达调控机制尚不清楚.用PCR方法扩增了枯草芽胞杆菌veg基因的启动子vegP,连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pHP13上,构建了表达型重组质粒pHP13-V.用PCR方法扩增了ribR基因,连接到pHP13-V上,构建了重组质粒pHP13-VR.将pHP13-VR转化产核黄素的枯草芽胞杆菌24A1,使ribR基因在24A1中组成型表达,得到菌株24A1/pHP13-VR.与24A1相比,24A1/pHP13-VR菌落由亮黄色变为微黄色,核黄素产量下降为1.26 mg/mL,下降了45%.结果说明,在ribC基因突变背景的过量合成核黄素枯草芽胞杆菌中,ribR基因的存在对菌株的核黄素发酵有一定的抑制作用.     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶酶的分离纯化

为了获得纯纤溶酶并探讨其酶学性质,从广泛收集的豆豉中筛选到一株具有高产纤溶酶能力的菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌.将该菌突变株DC-12N8的发酵液经离心除菌、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤,获得电泳纯的豆豉纤溶酶,每升发酵液可得到4.5mg活性酶蛋白,每克酶蛋白活力达1.18mol/s,纯度为发酵原液的53.6倍,回收率为11.7%.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,该酶是单链蛋白质,其分子质量约为28ku.