一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。     

3-烯丙基-2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹啉的合成研究

以3,4-二甲氧基苯胺和丙二酸为原料,在三氯氧磷作用下合成2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹啉,2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹啉在二异丙基氨基锂作用下与3-溴丙烯发生SNAr反应得到3-烯丙基-2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹啉. 2步反应总收率为66. 1%.产物结构经~1H NMR和ESI-MS确证.通过对反应条件研究确定最佳反应工艺,在该最佳反应工艺条件下2,4-二氯-6,7-二甲氧基-3-(2-甲基烯丙基)喹啉的合成收率为77. 5%. 3-烯丙基-2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹啉经过还原、氧化、取代反应得到3-(3-叔丁基二甲基硅氧丙基)-2,4-二氯-6,7-二甲氧基喹啉,3步反应总收率为42. 8%.     

马来松香丙烯醇酯聚合物的制备及表征

以松香为原料,通过3步反应,首次制得马来松香丙烯醇酯聚合物,探讨了酯化反应和聚合反应的最佳条件,对酯化产物进行了紫外、红外分析和酸值的测定;对聚合物进行了差热分析,软化点和分子量的测定.通过实验可以得出,酯化反应最佳条件为:马来松香与丙烯醇的物质的量之比为1∶3.5,催化剂的质量为马来松香的6.5%,反应时间5小时,最高温度为135℃;聚合反应最佳条件为:马来松香丙烯醇酯20克,三氯化铝3克,温度为75℃,反应时间4小时,所得产物容易分离纯化,最佳条件下所得酯化产物酸值99.7,酯化产率达96.3%;聚合物软化点240℃,平均分子量2632,聚合产率92.5%.     

以魔芋多糖为碳源的产聚羟基丁酸酯菌的筛选、鉴定及发酵研究

为充分利用发酵魔芋低聚糖所产生的菌体废弃物,降低微生物发酵法生产聚羟基丁酸酯(PHB)的成本,从云南省种植魔芋的土壤中分离得到一株以魔芋多糖为唯一碳源生长的菌株LKH,该菌可以分泌β-甘露聚糖酶水解魔芋多糖生长,并在胞内积累PHB。经形态学、生理生化特征及16S rDNA序列分析表明,菌株LKH归属于依利诺斯类芽孢杆菌。红外光谱和气相色谱分析结果显示,以魔芋多糖为碳源培养的细菌胞内提取的白色薄膜物质中含有PHB。当氮源(NH_4Cl)浓度为0.2g/L时,菌体以魔芋多糖为碳源合成的PHB质量最高可达0.85g/L,其含量达到69.55%,提取率为93.29%。     

台湾假单胞菌的分离、鉴定及其对难溶性磷酸盐的溶解特性

为了获得能高效转化土壤中难溶性磷酸盐的溶磷微生物,从武汉市园林科学研究所里的车前草根际土样中,根据溶磷圈的大小筛选出一株溶磷能力较强的细菌P2。经形态学、生理生化特征和系统进化分析,确定菌株P2归属于台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)。经条件优化后,菌株P2溶解磷酸三钙的最大溶磷量(以PO■计)可达到1267.89 mg/L,约为优化前的1.43倍。菌株P2对磷酸氢钙、羟基磷灰石、磷酸铝、磷酸铁和磷矿粉也有不同程度的溶解,溶磷量分别达到1752.58、1644.33、67.01、46.39、72.16 mg/L。高效液相色谱分析显示磷的溶出率与培养液中总有机酸浓度之间存在正相关性。菌株P2可明显提高土壤中的有效磷含量,具有良好的微生物肥料应用前景。     

重组葡萄糖脱氢酶的表达及辅酶再生应用研究

为解决异源表达酮还原酶域EryKR1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)催化环己酮还原时消耗的氢供体NADPH再生的问题,构建了克隆枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组菌E.coli BL21(pET28a-gdh),其中的gdh基因经Nucleotide BLAST功能分析显示与枯草芽孢杆菌9902的gdh基因序列(登录号为EF626962.1)的一致性达到100%。SDS-PAGE检测显示该重组菌经IPTG诱导后可以高效表达出葡萄糖脱氢酶(GDH),其表达量占全菌可溶性蛋白质的64%。GDH粗酶液的比酶活为137.90U/mg。通过气相色谱检测添加了E.coli BL21(pET28a-gdh)的E.coli BL21(pET28a-eryKR1)环己酮还原反应体系中的环己醇含量,结果显示加入重组GDH的双重组菌耦合反应体系中环己醇的产率为82.21%,是未添加GDH的反应体系对应值的3.23倍,表明重组GDH可以为EryKR1还原环己酮系统解决辅酶再生问题。