血小板生成素在枯草杆菌中的表达分泌及前肽作用

利用PCR方法扩增得到枯草杆菌本身的表达调控序列SP（含有信号肽）和Pro序列（包含信号肽和前肽）,分别与血小板生成素(TPO)结构基因及枯草杆菌载体片段连接,构建两个重组TPO枯草杆菌表达载体,转化受体菌,得到DB403（SP-TPO）和DB403（Pro-TPO）重组克隆,比较有无前肽对其表达分泌的作用.用ELISA和Western Blot检测TPO的表达分泌,发现DB403（Pro-TPO）能够表达分泌TPO,而DB403（SP-TPO）未发现TPO的分泌.对小鼠腹腔注射DB403（Pro-TPO）发酵浓缩液,发现能够明显增加血小板数目,与自身对照相比增加84.2％,与生理盐水对照比较增加99.7％.以上实验说明Pro-TPO能够表达分泌有明显活性的TPO蛋白,而且前肽对外源蛋白的分泌是必要的.     

利用枯草杆菌整合表达嗜铬粒蛋白抗真菌片段

为实现CGA1-76片段基因在枯草杆菌中的稳定表达,将CGA1-76片段基因的表达元件重组到枯草杆菌转座子质粒pHV1249微转座子mini-Tn10内,利用mini-Tn10将CGA1-76片段基因的表达元件整合到枯草杆菌DB1342染色体上,用氯霉素和红霉素筛选枯草杆菌转座工程菌DB1342(TnSVTQ).DB1342(TnSVTQ)在无选择压力条件下经10 d连续传代培养,转座子内氯霉素抗性丢失率为0%,说明转座子稳定整合在DB1342染色体上.SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明,在蔗糖诱导下,CGA1-76片段基因在DB1342(TnSVTQ)中获得表达,产物被分泌到细胞外.孔穴琼脂扩散法测定表达上清的抑制真菌活性,结果表明重组CGA1-76能抑制烟曲霉菌和黄曲霉菌的生长,抑菌圈直径分别为9 mm和8 mm.     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

分泌载体pPSA18的构建及地衣杆菌淀粉酶在枯草杆菌中的表达和分泌

本文报道利用枯草杆菌噬菌体Spol 的启动子Spac Ⅰ,合成的解淀粉芽胞杆菌信号序列及枯草杆菌质粒PUB 18重组,构建分泌型表达载体并将地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因(缺失启动子及信号序列)引入构建的载体,获得重组质粒pPSA 18.将此质粒转化枯草杆菌QB1130(amy~-)感受态细胞,在含5μg/ml 卡那霉素及1%可溶性淀粉的LB 平板上筛选Km~r 及淀粉酶阳性的转化子.从阳性转化子中提取质粒,经酶切分析后重新转化枯草杆菌QB1130,得到的转化子全部都能向胞外分泌淀粉酶,证明构建的载体能在枯草杆菌中表达和分泌外源基因产物.     

成孢延迟蛋白基因对枯草芽孢杆菌生物量和发酵酶活力的影响

探讨同种相噬对枯草芽孢杆菌内源酶发酵活力的影响.应用同源重组敲除的方法,构建了枯草芽孢杆菌168菌株的编码成孢延迟蛋白毒素前体的基因sdp C的knock-in突变株,比较了突变株和出发菌株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力.与出发菌株相比,突变株的生物量、芽孢数和α-淀粉酶发酵活力均显著提高,产酶高峰期酶活力提高23%.本研究结果显示,sdp基因突变不仅能够提高枯草芽孢杆菌的生物量,还能够提高其内源酶的发酵活力.     

透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌中的表达

采用大肠杆菌与枯草杆菌的穿梭质粒pMK4作为载体,构建了含有果聚糖酶基因(sacB)启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV.通过原生质体和电转化,将pMK-SV转入苏云金杆菌中,经影印筛选得到转化子Bt4.对Bt4诱导表达,与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2%.     

角蛋白酶基因kerB的提取、 克隆及表达

从角蛋白酶产生菌株地衣芽孢杆菌L-25中提取基因组DNA， 借助特定引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到kerB基因片段. 扩增后的kerB片段通过分子生物学方法克隆 到产酶缺陷型枯草芽孢杆菌DB104菌株敏感细胞中进行表达. 结果表明， 表达成功的FD-8菌 株（DB104/pLK18）可以在羽毛培养基上生长并完全水解羽毛.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

产嗜热性α—淀粉酶的嗜热脂肪芽孢杆菌的初步探讨

嗜热脂肪芽孢杆菌GR2是由嗜热脂肪芽孢杆菌CU21经诱变处理而获得的突变菌株。GR2菌株具有比出发株CU21高的最高生长温度;嗜热性α-淀粉酶的得率增加;并且不利用葡萄糖为主要碳源的性质。在连续培养中,GR2菌株的嗜热性α-淀粉酶得率随稀释率的增加或随培养温度的下降而增大,嗜热脂肪芽孢杆菌的克隆株GR2(PAT9)与GR2(PATHP9)的嗜热性α-淀粉酶得率比宿主CR2的嗜热性α-淀粉酶的得率高10倍。质粒PATHP9是由质粒PAT9经小型化后得到的。连续培养的结果表明,质粒小型化后,单位菌体的质粒的复制数增加,但基因表达效率下降。     

产酶苦豆子内生细菌筛选及其活性菌株鉴定

对苦豆子健康植株和种子内的内生细菌进行分离,共分离获得41株内生细菌.对41株菌株进行了分泌胞外淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶特性的研究.结果表明,有80.5%的菌株具有蛋白酶活性;有78.0%和61.0%的菌株具有淀粉酶和纤维素酶活性;具有几丁质酶和葡聚糖酶活性的菌株则较少.经16SrRNA基因序列分析鉴定,6株高活性产酶菌株与枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)、韩国丛毛假单胞菌(Pseudomonas koreensis)、固氮阴沟肠细菌(Enterobacter cloacae)、苍白杆菌(Ochrobactrum tritici)和嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)亲缘关系较近,核苷酸序列一致性在98%以上.     

枯草杆菌JAS株α—淀粉酶的产生与其抗衣霉素的关系

为了研究Bacillus subtilis的产α-淀粉酶性状与其抗衣霉素性状之间的关系,进一步选择在诱变育种时能有效地筛选淀粉酶基因突变株的方法,我们对此作了初步探索.衣霉素敏感型的α-淀粉酶工业生产菌B.subtilis JAS经过紫外线诱变后,选得9株抗衣霉素突变株.通过对它们进行的多次发酵酶活力测定,发现其中3株是α-淀粉酶缺陷型、3株酶活力基本不变或降低,另外3株酶活力明显提高,其中1株酶活力是出发菌株的114%—123%.试验表明B.subtilis α-淀粉酶的产生与其抗衣霉素基因的表达有着密切关系.因此,在对该菌的诱变育种时,可以采用衣霉素为粗筛选择压力.     

嗜铬粒蛋白N区抗真菌活性片段研究

为寻找高效低毒的抗真菌药物,利用PCR技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白N端18-76、18-66和31-76位氨基酸(CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76)的DNA片段,将之克隆进枯草杆菌诱导型表达载体pSBPTQ,获得3种重组质粒pSC18-76、pSC18-66和pSC31-76,转化枯草杆菌DB1342。SDS-PAGE分析结果显示:经蔗糖诱导后,CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76片段分别在枯草杆菌工程菌中获得表达,产物分泌到细胞外。表达量分别为5.6 mg/L、5.3 mg/L和5.6 mg/L。利用孔穴琼脂扩散法检测表达产物的抗真菌活性,并与CGA1-76进行比较,发现CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76对烟曲霉菌、黄曲霉菌、石膏样小孢子菌和白念珠菌均有抑制作用,并以CGA31-76对白念珠菌的抑制作用为最强,CGA18-66对除白念珠菌之外的另3种测试真菌的抑制作用较强,而CGA18-76对测试真菌的抑制作用最弱。     

黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育

以黑曲霉3.2130为出发菌株,经紫外线诱变处理,采用平板培养筛选,获得一酸性蛋白酶缺陷的菌株L4。通过对紫外照射时间、照射距离、孢子悬液稀释倍数的影响分析,得出最佳诱变条件,即照射时间180 s,照射距离30 cm,孢子液中孢子数量约为109个/L。该株的酸性蛋白酶活性为原始菌株的3.7%,而其β-葡萄糖苷酶活性基本不变,可作为外源基因高效分泌表达的宿主菌。     

人表皮生长因子（hEGF）基因合成及在枯草杆菌BS9920中分泌表达

采用PCR技术人工合成了一段长约175bp的人表生长因子（hEGF)的基因片段，为了便于克隆，在该片段的5′端设计了Pst I的酶切位点及与pUS186载体signal sequence相连接的碱基部分，在3′端设计了HindⅢ的酶切位点及终止密码子，经DNA分析，合成的片段与已发表的hEGF在序列上完全一致，之后将其克隆至枯草杆菌分泌型质粒载体pUS186上，构建重组载体pUSE并转化一株枯草杆菌突变菌株BS9920感受态细胞，以PCR法快速筛选重组菌落，RIA检测结果表明BS9920阳性转化子能够表达和分泌hEGF。     

短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统的建立及应用

为了实现对短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SCU11基因组连续地无痕改造,提高碱性蛋白酶产量,本文建立了基于Upp基因反向筛选的短小芽孢杆菌基因无痕修饰系统,将碱性蛋白酶基因AprE的1份拷贝无痕插入至短小芽孢杆菌染色体16S rDNA区.摇瓶发酵实验显示,突变菌株碱性蛋白酶活最高达到7125 U/mL,与出发菌株相比提高了33.1%.结果表明利用该系统可实现对短小芽孢杆菌基因组的无痕修饰,对AprE插入突变菌株进行双交换筛选的最终效率约为23.07%.     

铜绿假单胞杆菌调节基因突变株的分离及特性

铜绿假单胞杆菌ＰＡＯ１经过亚硝基胍诱变获得了弹性蛋白酶缺失的突变株。经弹性蛋白营养琼脂平板法，从１０次独立处理的６００００个菌落中得到７１株该酶缺失的突变株，其突变株对Ｎ－３－氧代己酰－Ｌ－高丝氨酸内酯（ＨＳＬ）诱导物有无反应分成２组。ＰＡＮＯ６７菌株在加入诱导物后能恢复该酶产生，经过菌落形态、生化特征和细胞膜蛋白质成份的分析，除该酶产生缺失外，突变株ＰＡＮＯ６７与亲本菌株ＰＡＯ１相同，结果表明，ＰＡＮＯ６７是弹性蛋白酶操纵子的调节基因发生突变的诱变菌株。     

产异淀粉酶黄杆菌菌株的诱变选育

以土壤中筛选到的产异淀粉酶的黄杆菌菌株D15为出发菌株,进行了紫外线诱变处理,通过对大量的突变株进行筛选,获得了一株产异淀粉酶活力较高且产酶稳定的菌株ZYF32,其酶活力达到9.21 U/mL,比原出发菌株提高了3.23倍。     

氮离子注入选育耐酸性α-淀粉酶产生茵诱变效应的研究

利用低能（30keV）氮离子注入中温中性α-淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌BF7658，研究对其产耐酸性α-淀粉酶的诱变效应结果表明，BF7658菌株存活率曲线是典型的“马鞍型”剂量-效应曲线，在“马鞍型”区域对应注入剂量50×10^14-100×10^14ions／cm^2下具有较高的突变率．通过诱变筛选到一株最适作用pH为5．0，较出发菌株的最适作用pH偏低一个单位的突变株，编号TUST743．该突变株产酸性α-淀粉酶的酶活为343U／mL．该酶在DH4．5和4．0条件下的相对酶活为61％和38％，说明此突变株所产酸性α-淀粉酶对低pH有较好的耐受性．经连续传代实验，表明该菌株遗传性质稳定、     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

解淀粉芽孢杆菌ptsGHI基因的敲除及缺陷株生长特性

在解淀粉芽孢杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要是由ptsGHI操纵子编码的酶EI、HPr、EIIGlc转运入细胞.文中运用PCR技术,扩增出ptsG和ptsHI基因上下游的DNA片段,共约1kbp,用融合PCR连接上下游片段后,再连接到温敏型质粒pKS2上,然后电转化到解淀粉芽孢杆菌XH7中,最终构建了ptsG和ptsHI基因缺陷株.实验结果显示:在LB培养基中,tsG及ptsHI基因缺陷株的生长状况与野生型菌株无明显差异;在含葡萄糖的LB培养基中,ptsG基因缺陷株的最高菌密度比野生型菌株提高了28％,且平稳期比野生型菌株要长,而ptsHI基因缺陷株的最高菌密度比野生型菌株降低了约32％,与其在LB中的生长状况基本一致;ptsG和ptsHI缺陷株及野生型菌株经鸟苷发酵实验后,ptsG基因缺陷株的鸟苷产量比野生型菌株提高了约24％,ptsHI基因缺陷株的鸟苷产量则比野生型菌株降低了约82％.以上结果表明:解淀粉芽孢杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和产物合成能力.