耐热酵母中海藻糖代谢途径对热胁迫的响应

海藻糖对酵母的耐热性有重要的作用：既是细胞保护剂，又是热激转录因子Hsf1p的正调节子.因此研究耐热酵母在热胁迫下海藻糖代谢途径的响应，有助于理解酵母的热响应机制，并为获得耐热的酿酒酵母提供理论基础.本文从转录及物质代谢角度对热胁迫下耐热酵母中海藻糖的代谢响应进行了研究.结果表明：在热胁迫下海藻糖代谢相关基因表达水平显著的升高，胞内海藻糖积累后有所下降，在耐热酵母海藻糖相关代谢基因水平和代谢物水平上的响应显示出高度的一致.本文的研究结果支持了热胁迫下酿酒酵母海藻糖作为细胞保护剂以及作为Hsf1p的正调节子的观点，进一步证实了海藻糖在酵母适应高温的过程中起重要作用.     

S7木聚糖酶辅助非木浆DQP漂白的效果

使用重组毕赤酵母基因工程菌发酵所得的S7木聚糖酶对麦草浆、芦苇浆、竹浆3种非木浆进行预处理(70℃,pH9.0),随后进行无元素氯DQP漂白,并与两种商品酶AU-PE89和Pulpzyme HC的助漂效果进行比较.结果表明,使用等量的化学助漂剂时,在高温强碱的条件下进行预处理的S7木聚糖酶,可将非木浆白度提高1%ISO以上,并可降低非木浆的卡伯值,提高非木浆的物理强度,效果与商品酶相近.通过扫描电子显微镜观察发现,经酶处理的纤维表面出现明显变化.     

利用SpyTag/SpyCatcher体系提高毕赤酵母重组蛋白生产能力

毕赤酵母是一种甲基营养型酵母,可以利用甲醇作为唯一的碳源和能源,是应用最为广泛的真核外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母的甲醇利用率和同化效率较低,高浓度甲醇对细胞有毒性,其中间代谢产物甲醛、甲酸等毒性物质的积累会严重抑制细胞生长,限制目的蛋白的产量。本研究拟在毕赤酵母过氧化物酶体中,利用多酶组装技术在甲醇代谢关键酶之间构建底物通道,减少甲醛积累,增大同化途径通量,提高甲醇耐受性,提高毕赤酵母表达外源蛋白能力,获得高效利用甲醇的毕赤酵母人工细胞。研究首先采用双分子荧光互补(BiFC)分析技术验证了多酶组装技术—SpyTag/SpyCatcher体系在毕赤酵母中自组装的可行性,随后利用SpyTag和SpyCatcher成功实现了甲醇氧化酶(AOX)和二羟丙酮合酶(DAS)在胞内自组装形成双酶复合体;在此基础上,引入绿色荧光蛋白EGFP作为报告蛋白,考察表达自组装双酶复合体的重组毕赤酵母利用甲醇进行细胞生长和重组蛋白合成的能力。结果显示,在2%(体积分数)甲醇培养基中,相比原始菌株,表达双酶组装体系的重组菌株的生物量提高了2.3倍,单位D(600)细胞表达的EGFP荧光强度提高了4.51倍,是未...     

耐热酿酒酵母海藻糖代谢途径对热胁迫的响应

为深入探讨酵母的热响应机制,测定了热胁迫条件下耐热酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中海藻糖含量的变化,并通过实时定量聚合酶链式反应,分析了热胁迫下参与海藻糖代谢的相关基因的表达.结果表明:在42℃热胁迫下,酿酒酵母细胞内的海藻糖含量显著提高,在处理240min时达到0.20g/g(以细胞干重计),约为热胁迫前的4倍;随着胁迫时间的增加,胞内海藻糖的含量开始下降。参与海藻糖代谢的基因表达变化与海藻糖含量变化高度一致,说明海藻糖在酵母适应高温的过程中起重要作用.     

gD2 DNA疫苗诱导细胞免疫应答

用生殖器疱疹gD2 DNA疫苗pcDNA3-gD转染哺乳动物细胞COS-7，鉴定gD表达．再用其免疫BALB／c小鼠，测定脾细胞增殖、CTL细胞杀伤活性，以及CD4^ 和CD8^ 细胞群．结果表明：pcDNA3-gD能够在哺乳动物细胞COS-7中表达gD抗原，其免疫小鼠脾细胞增殖活性增加，CTL活性达37．69％，明显高于pcDNA3组和生理盐水组；CD4^ 占T细胞数量的33．38％，数量较pcDNA3组和生理盐水组显著增加．     

生物表面活性剂的生产与应用

生物表面活性剂主要由微生物发酵和酶催化下合成，具有表面活性剂基本结构与性质的物质，其除了具有化学表面活性剂的特点外，还具有生物兼容性高、安全无毒性、可被生物降解、不会对环境造成不利影响等优点。随着环保意识的增强和食品安全级别的提高，生物表面活性剂开始应用于食品、医药、化妆品、洗涤剂和石油化工等领域，研究开发各种高效、低成本的生物表面活性剂生产技术成为生物化工的研究热点。     

金黄色葡萄球菌功能蛋白的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统,成功地将金黄色葡萄球菌功能蛋白ZZ锚定在酵母表面,并进一步用展示有蛋白ZZ的酵母细胞纯化出兔IgG.以pEZZ18为模板,通过PCR技术克隆了ZZ基因,将ZZ基因通过双酶切连接到穿梭载体pICAS,构建了酵母表面展示载体pICZZ,并将其转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)MT8-1中.核酸电泳结果表明ZZ基因成功整合到了酵母基因组中.重组菌经培养,利用免疫荧光染色方法进行染色,显微镜观察表明ZZ蛋白已经展示在酵母细胞表面,流式细胞仪分析结果证实80.4%的酵母细胞表达了ZZ蛋白.利用展示有蛋白ZZ的酵母细胞吸附兔血清中的IgG,洗脱后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电脉,并进行W estern blot免疫印迹,结果表明,此重组酵母细胞纯化的兔IgG比标样兔IgG纯度更高.     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

DNA疫苗经基因枪介导的免疫研究

将基因枪介导的DNA疫苗用于小鼠腹部免疫，并用免疫组化法检测gD抗原在接种部位的表达，利用ELISA检测血清中的抗gD抗体，并采用病毒攻击检测DNA疫苗对动物的保护效果。结果表明，基因枪可有效地将DNA质粒运送至小鼠皮肤组织，DNA疫苗携带的抗原保护基因gD2糖蛋白能在真皮和肌肉组织中高效表达。同时，免疫小鼠体内产生高滴度的中和抗体，能有效抵抗HSV2病毒的攻击。     

重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析

建立稳定有效的细胞壁蛋白(CWPs)抽提方法,是开展毕赤酵母细胞壁蛋白质组学及甲醇代谢调控相关性研究的基础.为此,以具重组非共价结合壁蛋白Flo1p絮凝素的酵母GS115/KFS-CALB、具共价结合壁蛋白α凝集素的酵母GS115/KNS-CALB和具重组共价结合壁蛋白Pir1的酵母GS115/Pir1-CALB为对象,用热十二烷基磺酸钠(SDS)、昆布多糖酶、氢氟酸吡啶和温和碱水解对上述壁蛋白进行抽提,结果表明:3种壁蛋白已成功地展示于毕赤酵母细胞壁的表面;用这3种毕赤酵母锚定蛋白展示脂肪酶,对细胞的生长状况影响不大,而对展示酶的表达量影响较大,GS115/KFS-CALB、GS115/KNS-CALB和GS115/Pir1-CALB的脂肪酶水解比酶活最高达855.02、1239.40和210.47 U/g(以干细胞计);热SDS可有效抽提GS115/KFS-CALB上的Flo1p絮凝素,昆布多糖酶和氢氟酸吡啶可释放GS115/KNS-CALB上的α凝集素,而昆布多糖酶和温和碱可释放GS115/Pir1-CALB上的Pir1.