重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶(Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn-SOD)工程菌的摇瓶发酵的培养基(碳源、氮源、无机盐)和培养条件(接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等)进行了初步优化.结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分(质量分数)为:1.5%蛋白胨、1.5%酵母提取物、1.0%NaCl、0.4%KH2PO4、0.8%K2HPO4、1.5%(体积分数)甘油、0.2%NH4Cl和5 mmol/L MnCl2.乳糖诱导表达的优化条件为:以5%接种量培养5 h后,加入质量分数为0.25%的乳糖进行诱导表达6 h.当发酵温度为37℃、摇床转速为180 r/min、培养基的初始pH值为7.0时,表达的rMn-SOD的酶活力高.在优化条件下,工程菌的SOD活性达1 969.9 U/mL,比活力达1 081.8 U/mg.     

酶解龙须菜粗多糖硫酸基工艺优化

为探索重组芳香基硫酸酯酶水解龙须菜粗多糖的动态过程变化,同时为重组酶的应用提供基础数据,以p ET-28a为表达载体,在大肠杆菌(E.coli)中诱导表达获得能特异性水解硫酸酯的重组芳香基硫酸酯酶.并利用重组芳香基硫酸酯酶水解海藻龙须菜中的硫酸基团,以硫酸基含量和硫酸基脱除率为指标,利用单因素试验研究各因素对龙须菜粗多糖硫酸基水解过程的影响.试验确定了脱除龙须菜粗多糖硫酸基团的工艺条件,结果表明,重组芳香基硫酸酯酶水解龙须菜粗多糖的适宜工艺条件为:水解温度40℃,p H值7.0,初始底物5 g/L,加酶量108.14 U,振荡速率120 times/min,酶解反应2 h,在此工艺条件下脱除了78.4%的硫酸基团,凝胶强度提高2.1倍,凝固温度、融化温度分别为38.4℃和91.3℃.重组芳香基硫酸酯酶在酶解过程中水解龙须菜粗多糖中硫酸酯表现出较高的活力.     

诱导条件对重组人锰超氧化物歧化酶发酵的影响

分别研究了3种诱导剂和Mn^2＋浓度对重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）发酵表达的影响,并进一步优化了乳糖诱导rhMn-SOD表达的条件。结果表明：异丙基--βD-硫代半乳糖苷（IPTG）和乳糖诱导能够获得类似的表达效果,诱导的同时加入2 mmol/L的Mn^2＋能够明显提高rhMn-SOD的表达。进一步的实验结果表明：乳糖诱导的最佳浓度为7 mmol/L,最佳时机为接种后6 h,A600为2.1,诱导表达6 h rhMn-SOD活性和比活达到最高。     

LHRH-PE40工程菌发酵条件的初步研究

利用摇瓶在温度、pH范围、诱导剂量及诱导时间等不同因素变化时，进行了重组毒素LHRH-PE40工程菌发酵条件的初步探索.结果表明，工程菌优化的发酵条件为：pH范围7．3～7．5，诱导温度为34℃．诱导时菌密度A600=0．8，诱导时间为4～4．5h，诱导剂(IPTG)浓度为0.5mmol/L。     

高效表达AIM工程菌的发酵培养基及发酵条件优化

为了进一步提高工程菌的载脂蛋白AI米兰突变体(AIM)的表达量,降低发酵成本,通过碳氮源优化实验并结合正交实验筛选出该工程菌产AIM的最适培养基为(g/L):蔗糖10,酵母粉10,硫酸铵6和NaCl 10;最适发酵条件为:装液量30 mL,接种量8%,诱导时机A600 1.0,诱导剂浓度0.8 mmol/L,诱导时间6 h.在此优化的条件下,AIM的表达量为2.26 g/L,是未优化条件下的1.58倍.     

人Cu，Zn-SOD在重组毕赤酵母中表达的发酵工艺研究

以表达人Cu,Zn-SOD的重组毕赤酵母为出发菌株,通过摇瓶实验研究发酵初始pH值、诱导剂浓度、诱导温度和培养基组成等因素对目的蛋白表达水平的影响.实验结果表明,培养基组分对目的蛋白表达水平的影响最大.与YPG培养基相比,菌株在FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4)中目的蛋白表达量提高5.5倍.在优化摇瓶发酵条件下(诱导剂浓度1%,诱导温度27℃,FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4),初始pH值为6.0),发酵液上清酶活水平为895 U/mL,较初始提高8.5倍;以摇瓶实验结果指导5 L罐发酵,得到13 539 U/mL酶活,为摇瓶试验的15倍.     

基因重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子的发酵条件优化

采用三角摇瓶来优化基因工程菌表达重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子(SCAIF)的最佳发酵条件,并以此为基础在Biotop CF-10L自动控制发酵罐进行发酵培养.基因工程菌BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)诱导表达SCAIF蛋白的最佳摇瓶培养条件是:接种量为2%、装液量为75 mL/500 mL、加入IPTG的诱导时间为培养2 h后、IPTG浓度为0.25 mmol/L、诱导时间为2 h.BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)菌种在Biotop CF-10L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到10 L发酵培养基中,设定pH 7.0,温度37℃,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导2 h后终止发酵.发酵罐中获得的菌体量为10.2 g/L,蛋白表达率为25%左右.     

猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵

从发酵时间、接种量、pH值、诱导剂量等方面对重组基因工程（毕赤酵母甲醇利用缓慢型）的摇瓶发酵条件进行了优化，进一步探索了酵母菌表达猪IFNα的发酵工艺，包括种细胞密度对初始发酵期的影响，补加甘油、甲醇速率条件的控制等．结果表明，摇瓶发酵时，诱导最佳时间为96h，甲醇最适浓度为8g/L，发酵pH范围为6.4～9．0．最适接种量2：1．在分批发酵、接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为5～6时，最有利于细胞的高密度培养，在补料发酵时，根据溶氧控制甘油流加速率与时机，细胞干重达到118．75g／L，在48h重组猪IFNα表达量达到1。304g／L．     

重组SOD在毕赤酵母中表达的发酵工艺研究

以实验室构建的产SOD重组菌为出发菌株,研究其摇瓶发酵工艺条件以提高表达水平,进而在5L高密度发酵. 以确定接种后诱导时间（16h）、诱导剂浓度（2%）、温度（30℃）、初始pH值（6.2）和诱导时间72h为条件,摇瓶水平酶活比初始时提高了64%;经5L罐发酵实验,酶活达到40864U·mL^-1,是摇瓶的86倍.     

摇瓶中重组大肠杆菌生产人γ-干扰素工艺优化

目的优化大肠杆菌生产重组人γ-干扰素摇瓶发酵工艺条件,分析摇瓶发酵过程中的制约因素。方法在摇瓶中研究了种子菌龄、接种量和诱导时机等因素对工程菌生产rhIFN-γ和质粒稳定性的影响,及优化条件下工程菌发酵参数。结果最佳条件:种子液为OD6000.5~1.5,接种量为6%,培养至OD600为1.5时42℃诱导表达4 h。在此条件下,在摇瓶中使用M9II培养基时,质粒无丢失,摇瓶中rhIFN-γ的表达量占菌体总蛋白的43.2%,光密度为3.3。对发酵过程中总糖、还原糖、总氮和pH的分析表明,发酵过程中培养基中碳源、氮源丰富,而溶解氧的不足和pH值偏酸性可能是整个培养过程的限制性因素。结论构建的工程菌发酵的稳定性和重复性良好,为rhIFN-γ的大规模生产提供可靠的放大依据。     

产菊酯降解酶重组菌的高密度发酵工艺优化

为提高菊酯降解酶的产量,利用单因素和正交实验法对重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sys410的发酵培养基组成和发酵条件进行优化。结果显示最优培养基含有20.0 g·L-1甘油、20.0 g·L-1酵母粉、8.0 g·L-1硫酸铵、100.0 mmol·L-1磷酸盐、5.0 mmol·L-1硫酸镁,以及1.5 m L·L-1的微量元素;发酵条件为装液量50 m L/250 m L、初始培养基pH 7.0、接种量2%,接种培养8 h后乳糖诱导6 h。在7.5 L发酵罐上,使用低浓度碳氮源进行培养,前期恒速补料,对数中后期进行乳糖诱导,后期恒溶氧补料,最终菌体密度和酶活力分别为142.6和3 105.1 U·m L-1,较摇瓶发酵分别提高13.7倍和31.9倍。发酵液经破碎和冷冻干燥后酶活力达到119 426.9 U·g-1,且该酶对菊酯的降解率高于95%。     

溶氧反馈-分批补料高密度培养枯草杆菌谷氨酰胺合成酶工程菌

为了建立枯草杆菌谷氨酰胺合成酶基因重组工程菌BL21/pET28b-glnA的高密度培养工艺,首先以摇瓶培养为基础,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、pH值、诱导剂浓度及时间等进行优化,再扩大至BIOTECH-SBG(5 L)自动玻璃发酵罐培养,利用溶氧反馈补料策略进行分批补料,并在培养过程中保持20%～50%的溶解氧,7.0～7.5的pH,以及1.0g/L乳糖诱导12 h,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终细菌干重达到48.1 g/L,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的55%,粗提物酶比活为10.35 U/mg,整个补料过程细菌比生长率稳定的控制在0.1 h-1左右.     

重组VEGF-A_189发酵、纯化及鉴定

为了获得大量重组血管内皮生长因子(VEGF-A_(189))蛋白的可溶性表达,对重组VEGF-A_(189)工程菌进行发酵条件的优化并开展发酵研究.通过摇瓶培养进行可溶性发酵条件优化,在5 L发酵罐中发酵重组VEGF-A_(189)工程菌,将发酵产物经镍离子柱亲和层析纯化,并对发酵产物进行SDS-PAGE,Western Blot和ELISA等分析鉴定.结果表明,重组VEGF-A_(189)工程菌可溶性发酵条件为:37℃培养重组VEGF-A_(189)工程菌4 h,加入0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于28℃诱导表达4 h.在5 L发酵罐中按比例放大发酵,在补料发酵3.5 h后菌体密度(A_(600nm))达到8.0,调整发酵温度到28℃,IPTG诱导4 h后的菌体密度为13.72,菌体产量为40 g/L.镍离子柱亲合层析纯化后重组VEGF-A_(189)纯度达到90%以上,回收率大于80%,Western Blot、ELISA分析结果显示,重组VEGF-A_(189)蛋白和抗VEGF抗体有良好的结合活性.结果表明经过发酵条件优化后发酵可获得有免疫结合活性的可溶性重组VEGF-A_(189)蛋白.     

毕赤酵母工程菌发酵生产重组Cu/Zn-SOD的工艺研究

系统考察毕赤酵母工程菌GS115表达重组铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的发酵工艺参数,优化后5 L发酵罐上生产工艺为:采用BSM培养基,接种量5%(体积分数),发酵温度35℃,诱导期搅拌转速900r·min-1,pH值为6.0、维持溶氧(DO)水平为饱和值的20%以上.经过142 h发酵实验,SOD活力最高可达102.789 kU·mL~(-1),比优化前提高3.5倍.采用毕赤酵母工程菌能实现高效、大量制备优质动物来源的Cu/ZnSOD重组蛋白,具有良好的产业化潜力和广泛的应用前景.     

抗艾滋病病毒蛋白CVNH在大肠杆菌中表达条件的优化

CVNH(Cyanovirin-N homology)蛋白家族是具有抗HIV活性的蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)的同源物。在前期研究中,已首次获得水蕨Ceratopteris thalictroides CVNH基因的全长序列,构建了pET32a-CtCVNH的原核表达载体。以此为基础,对CVNH在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)中的表达条件进行优化。分别探讨了最佳培养基类型及成分、培养基初始pH、诱导时机、诱导剂浓度及诱导时间。优化后的诱导条件是:含24 g.L-1酵母提取物和72 g.L-1胰蛋白胨的TB培养基、培养基初始pH为8.0、菌液A600nm为0.6时加入1.6 g.L-1乳糖诱导6 h。CVNH蛋白的表达量较优化前提高了1.9倍。这为进一步开展CVNH的药物研制和开发奠定基础。     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白的优化表达

研究培养基成份、pH值、接种量、诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平的影响.SDS-PAGE电泳分析结果表明:在37℃的LB培养基中培养3h,用终浓度为0.3mmoL/L的IPTG于30℃诱导5h时表达水平最高.苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64重组蛋白在大肠杆菌中的优化表达为深度解析其在病毒感染过程中的功能奠定了基础.     

鲨鱼软骨活性段蛋白在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索菌种BL21（DE3）/pET3C-aSCAIF表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养.摇瓶培养最优条件：2%接种量、25 mL LB培养基、37℃培养、0.5%的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高.菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为：以10%的接种量接种到2.5 L发酵培养基中,设定溶氧30%,pH7.0,温度37℃,通气量3 L/min,流加甘油15 g,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后终止发酵,发酵罐中获得的菌体量为62.1 g.     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

正交实验优化RGD-蛛丝蛋白基因工程菌高密度发酵条件

通过正交实验对RGD-蛛丝蛋白基因工程菌高密度发酵条件进行优化.选择pH、温度、诱导剂、前体物甘氨酸/丙氨酸4因素,分别在3个水平上进行考察.当菌体密度OD600 nm为35左右时,添加IPTG诱导5 h,确定了发酵诱导条件为前体物甘氨酸/丙氨酸质量浓度为0.5%,诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L,pH为7.0,温度为37℃.工程菌密度OD600 nm 可达到53.1,目的蛋白比例可达到24.3%,每L发酵液菌体经纯化可得到410 mg的目的蛋白.     

重组大肠杆菌DH5α生产rhTum-5-NGR培养条件的优化

目的提高重组大肠杆菌DH5α生产rhTum-5-NGR的能力。方法在摇瓶中研究了种子菌龄、接种量和诱导时机等因素对菌体生长及rhTum-5-NGR表达量的影响。结果最佳条件为接种量2%,初始pH为7.2,装液量30%,37℃培养至OD_(600)为2.3左右时加入0.5mmol/L IPTG,诱导表达4h。在此条件下,摇瓶中rhTum-5-NGR的表达量占菌体总蛋白的40.1%,光密度为5.94,生产能力为2.38,较优化前(0.82)提高了1.9倍。结论构建的工程菌发酵的稳定性和重复性良好,为肿瘤新药rhTum-5-NGR的工业化生产奠定基础。