基因重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子的发酵条件优化

采用三角摇瓶来优化基因工程菌表达重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子(SCAIF)的最佳发酵条件,并以此为基础在Biotop CF-10L自动控制发酵罐进行发酵培养.基因工程菌BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)诱导表达SCAIF蛋白的最佳摇瓶培养条件是:接种量为2%、装液量为75 mL/500 mL、加入IPTG的诱导时间为培养2 h后、IPTG浓度为0.25 mmol/L、诱导时间为2 h.BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)菌种在Biotop CF-10L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到10 L发酵培养基中,设定pH 7.0,温度37℃,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导2 h后终止发酵.发酵罐中获得的菌体量为10.2 g/L,蛋白表达率为25%左右.     

正交实验优化RGD-蛛丝蛋白基因工程菌高密度发酵条件

通过正交实验对RGD-蛛丝蛋白基因工程菌高密度发酵条件进行优化.选择pH、温度、诱导剂、前体物甘氨酸/丙氨酸4因素,分别在3个水平上进行考察.当菌体密度OD600 nm为35左右时,添加IPTG诱导5 h,确定了发酵诱导条件为前体物甘氨酸/丙氨酸质量浓度为0.5%,诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L,pH为7.0,温度为37℃.工程菌密度OD600 nm 可达到53.1,目的蛋白比例可达到24.3%,每L发酵液菌体经纯化可得到410 mg的目的蛋白.     

大肠杆菌表达高性能融合鱿鱼环齿-类弹性蛋白的发酵优化

为了实现重组蛋白SRT-ELP36在大肠杆菌中的高效表达,利用携带重组蛋白SRTELP36基因的pET-25b(+)表达载体,分别在摇瓶和5 L发酵罐上进行了发酵条件优化,并在50 L发酵罐中进行放大验证。经转化表达质粒后,宿主菌BL21(DE3)的菌体生长和蛋白体积产量均高于BLR(DE3),可用于蛋白SRT-ELP36表达。摇瓶发酵条件优化结果表明,TB(Terrific Broth)培养基、装液比(装液量与摇瓶体积之比)为5%、诱导温度为37℃、对数生长结束期添加0.5 mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂,菌体最高OD₆₀₀(波长600 nm处的吸光值)达到22.3,最高蛋白体积产量达0.60 g/L。在5 L发酵罐中进行补料分批培养条件优化,在OD₆₀₀为35时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG启动诱导,并控制过程菌体氧消耗速率(OUR)为(180±5) mmol/(L·h),菌体的最高OD₆₀₀和蛋白体积产量分别达到了88、1.85 g/L,单位菌体蛋白产量为70 mg/g。在...     

细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化

目的:获得细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(exCTLA4)在大肠杆菌中高效表达的条件,并纯化获得高纯度的重组蛋白.方法:构建原核表达质粒pET28a-exCTLA4并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,通过改变诱导物IPTG浓度、细菌培养温度和时间,获得了exCTLA4的最佳表达条件.收集最佳诱导条件下表达exCTLA4的菌体,将菌体超声破碎后,离心分离exCTLA4包涵体,用低浓度尿素(2mol·L~(-1))洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8mol·L~(-1))溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度exCTLA4.结果:构建了表达载体pET28a-exCTLA4,获得了exCTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在1mmol·L~(-1) IPTG、25℃下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在.通过纯化exCTLA4包涵体及进一步的镍离子亲和层析获得了高纯度的目的蛋白,Western blot鉴定为CTLA4.结论:获得了exCTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件和纯化方法及步骤,为该蛋白的应用奠定了基础.     

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养;利用Western blotting进行发酵产物鉴定. 摇瓶培养最优条件:10%接种量、25 mL LB培养基、37 ℃培养, 0.02 g/mL的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3h后目的蛋白表达量最高. BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到3L发酵培养基中,设定溶氧40%,pH7.0,温度37 ℃,通气量3 L/min,快速流加甘油60 g ,培养4 h后,加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3 h后终止发酵. 发酵罐中获得的菌体量为36 g/L,蛋白表达率为10%左右.     

重组人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白的可溶性表达、纯化和对肿瘤细胞的抑制活性

以人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）为研究对象,根据大肠杆菌密码子偏好性优化,通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列,连接至pET-24b载体中,并转化入大肠杆菌BL21 (DE3)及BL21 ( DE3) plyS中进行诱导表达。结果显示,在含有2 mg/mL葡萄糖的LB培养基中37 ℃培养至OD-600约为0.6 h,加入0.2 mmol/L IPTG在30 ℃诱导2 h后,重组蛋白可以实现可溶性高表达。工程菌经超声波破碎、高速离心后,经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白,蛋白纯度达到95 %以上,蛋白最终得率在2.6 mg/g菌体。重组蛋白经IC-50检测,可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长。     

麻疯树小热激蛋白JcHSP-17.5的纯化与活性鉴定

将实验室已有的pET32a-JcHSP17.5重组载体,经测序验证后,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,不同温度条件下,用不同浓度异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,优化表达条件;选择镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化JcHSP-17.5蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度;通过热激聚合反应来鉴定蛋白的分子伴侣活性.结果表明,17℃,200r/min,0.5mM IPTG诱导13h为JcHSP-17.5蛋白的最佳诱导表达条件,使用200mmol/L咪唑缓冲液纯化蛋白后,每500mL菌液可得到1.345mg的电泳纯蛋白,该蛋白在高温(45℃)条件下能够阻止苹果酸脱氢酶(MDH)发生聚合反应,表现出较强的分子伴侣活性.     

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

重组风雨花凝集素在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高重组表达质粒pET32c-ZGA在大肠杆菌中的表达量,对表达重组风雨花凝集素基因工程菌的培养条件进行优化筛选,对影响蛋白质表达量和工程菌生长的因素如pH值、诱导温度、IPTG、接种量、诱导时间、补充碳源形式、诱导时机、无机离子等进行了探索.经过优化,重组融合目的蛋白占菌体总蛋白的61.8%,比优化前提高了13.4%.条件优化后,pET32c-ZGA工程菌经过放大培养,获得6 g/L的湿菌体量,超声波破碎菌体,SDS-PAGE证实重组融合蛋白以包涵体形式表达.     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

Hepc 20在毕赤酵母中的胞内表达及鉴定

构建了Hepc 20的毕赤酵母表达载体,在毕赤酵母中能成功表达有活性的Hepc 20。优化了菌株的培养诱导条件,结果表明BMMY培养基是Hepc 20表达和重组菌株生长的最佳培养基,甲醇诱导终体积分数0.5%,在此条件下Hepc 20在重组菌株中的表达量约为3.6 mg/L。Western blot检测显示的22000处的条带为重组Hepc 20条带;ELISA验证表明重组Hepc 20可以跟抗体特异结合,琼脂扩散法抗菌实验表明重组Hepc 20对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性。     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子类似物在大肠杆菌中的分泌表达研究

用带有大肠杆菌外膜蛋白信号肽序列的重组分泌型表达载体pSE-hbFGF，在大肠杆菌BL21中分泌表达了rhbFGF类似物。SDS－PAGE、免疫印迹结果表明，表达产物分泌到了细胞周质和培养液中，用间接ELISA测定出培养上清中的rhbFGF类似物为24.5mg/L，周质中为36.5mg/L菌液（O.D600nm=10)。同时探讨了发酵培养中影响rhbFGF表达的几个关键因素，如诱导时期的选择、诱导时间的长短、培养基的选择及诱导剂的浓度等。     

人EC-SOD的克隆及高效表达

将编码人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）成熟肽的cDNA插入含T7启动子的质粒pET-28a( )中构建表达质粒pET-EC-SOD，表达菌株用1mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达3h-5h后，产生较多的重组人EC-SOD，并形成包含体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白质的26%以上。经纯化和复性后的EC-SOD比活为每毫克纯化酶蛋白1200U。将EC-SOD转染粉纹夜蛾Tn-5Bl-4细胞，经扩增后在细胞内进行表达。SOS-PAGE分析结果表明，粉纹夜蛾细胞中表达一相对分子质量约为28ku的特异蛋白质带，Western blot分析表明，该特异条带即为EC-SOD蛋白，连苯三酚自氧化法测得表达产物比活为每毫克细胞裂解物260U。     

人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及HAT活性测定

人Elp3蛋白(human Elongator protein 3,hElp3)是组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸,其功能异常与人类多种疾病相关.目前对其羧基末端高度保守的第二功能域研究较少.以pYES2hElp3质粒为模板,PCR获hElp3基因全长,插入改造的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母菌GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析和G418筛选得到Mut+型多拷贝整合菌.0.5%的甲醇诱导hElp3高效分泌表达,Ni-NTA纯化及Western印迹证实获目的蛋白.OPA法测得其拥有良好的HAT活性,为体外测定其第二结构域是否拥有催化活性奠定了基础,对筛选抑制其HAT活性的小分子药物用于疾病治疗研究至关重要.     

毕赤酵母表达Neuritin蛋白的纯化及鉴定

为研究重组Neuritin的毕赤酵母表达蛋白的纯化方法及鉴定。应用甲醇诱导GSll5/pPIC9K-Neuritin毕赤酵母工程菌株表达Neuritin蛋白,采用硫酸铵盐析、His-Trap Crud亲和层析等方法,对该表达产物进行纯化。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE、western-blot和生物质谱鉴定。结果显示,SDS-PAGE分析显示经甲醇诱导后表达的蛋白获得了与Neuritin分子量理论值相符的条带,western-blot分析它能够与抗表位抗体特异反应,进一步生物质谱分析证实该纯化重组蛋白为Neuritin重组蛋白。由此可知,本研究建立了一种有效的纯化方法,获得高纯度的Neuritin重组蛋白,为大量制备Neuritin纯化蛋白,开展其功能和机制研究奠定基础。     

传染性非典型肺炎病毒核蛋白的表达与活性检测

用PCR方法，人工合成传染性非典型肺炎病毒(SARS-CoV)核蛋白(N)全编码基因，并构建原核表达载体．在大肠杆菌中进行表达．结果重组N蛋白表达产量占菌体总蛋白的40％以上，主要以可溶形式存在．用SARS患者急性期血清进行蛋白印迹检测，表明可溶形式和包含体形式均有明显活性．包含体形式的重组蛋白经纯化后纯度可达90％以上，活性与纯化前相当，可作为SARS抗体诊断试剂盒的抗原原料．     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.