人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg~(-1),5 L发酵液上清酶活为909U·mg~(-1).发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg~(-1),并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.     

葛仙米中SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从葛仙米（Nostoc sphaeroides）总DNA中克隆了一段基因序列,该序列与基因库中已公布的编码普通念珠藻（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为98％,将该基因插入含T7启动子的质粒pET-32a（＋）中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用lmmol／L1PTG诱导表达数小时后,产生较多重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在,SDS-PAGE分析表明：在相对分子量约为22kd的位置有一条明显蛋白质带,将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2550U。     

谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母菌的初步表达

从重组菌株pPIC3.5k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经Sac I酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

超滤质谱法研究大黄蒽醌类化合物与 人血清白蛋白的相互作用

从重组菌株pPIC3.5 k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经SacⅠ酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

SOD-肝素结合结构域融合蛋白的毕赤酵母重组菌株构建及表达

利用基因工程技术将人源Cu, Zn-SOD与EC-SOD的C末端肝素结合结构域（HBD）的编码序列进行密码子优化并人工合成,然后电转化至毕赤酵母进行表达.单因素实验表明,与现有研究的一些重组EC-SOD相比,其比活力提高了1.30～3.78倍.正交分析得最佳摇瓶条件为诱导时间为5 d,初始pH值为5.2,诱导剂量的体积分数为1.0%,酶活可达1 120.2 U?mL^-1,是初始酶活的2.94倍;这些结果表明,SOD-HBD融合蛋白在一定程度上解决了重组EC-SOD表达量低的问题,为重组EC-SOD蛋白的推广与应用提供重要的物质基础条件.     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

hIL-10在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

构建了含有人白细胞介素-hIL-10（Human Interleukin10，hIL-10）基因的重组质粒，在大肠杆菌中的高效表达，并对其生物学活性进行了鉴定．用RT-PCR扩增hIL-10 cDNA，并插入原核表达载体PET-32b．将重组质粒转入BL21（DE3）感受态细胞，在37℃用IPTG诱导hIL-10表达．表达的重组蛋白经复性纯化后，用夹心ELISA法检测其对外周血单核细胞（PBMC）合成IFN-γ的抑制作用．重组质粒PET-32b／hIL-10的DNA序列分析显示，克隆的DNA序列和文献报道的hIL-10 cDNA序列一致．SDS-PAGE表明，重组蛋白相对分子质量为18000．活性测定结果显示，重组蛋白能显著抑制PBMC合成IFN-γ．这表明构建的PET-32b／hIL-10可以在大肠杆菌中高效表达，经复性和纯化后，获得了具有高纯度和活性的hIL-10     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

一种简便快速工艺制备重组人胸腺肽α1

将构建的含有胸腺肽α₁融合蛋白的编码基因插入表达质粒pET28a(+)中，并在大肠杆菌BL21中进行表达，该菌经IPTG诱导融合蛋白高表达后，离心收集菌体，超声波破碎，包含体裂解，目标蛋白质的体外变性复性后，经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化，每升菌液中可获得260mg融合蛋白。经重组肠激酶酶切反应、Ni-Sepharose亲和层析，Sephadex G-25柱纯化后，得到了纯度达97%的重组人胸腺肽α₁，该纯化工艺简单快速，经三步层析即可得到纯度达97%的重组人胸腺肽α₁，且产量达82mg/L，为大批量用细菌表达重组人胸腺肽α₁及纯化提供了参考。     

甜菜夜蛾多核壳型核型多角体病毒vp39基因的克隆与表达

参照苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV)衣壳蛋白基因vp39的序列设计引物,采用PCR技术扩增了甜菜夜蛾核型多角体病毒的约1．3kb片段,通过将片段亚克隆至原核表达载体pET-28构建出重组表达质粒pET-Se39,以pET-Se39转化E.coli BL21。经IPTG诱导后,SeMNPVvp39基因高效表达,SDS－PAGE分析显示表达产物的分子量为39KD,并且表达量在IPTG诱导4h达到最高水平。／     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白7原核表达载体的构建

胰岛素样生长因子结合蛋白7（简称IGFBP7）广泛存在于多种正常的组织中，但在相应的肿瘤细胞中的含量极微。试验表明，它在肿瘤发生的不同阶段抑制其生长。采用RT－PCR和Nest-PCR方法，从正常的小鼠脾脏中扩增得到IGFBP7 cDNA片段，测序正确后，克隆于融合表达载体pRSETC中构建原核表达重组体。     

血管内皮抑素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

血管内皮抑素不仅能特异性地抑制血管内皮生长，而且对血管形成和肿瘤生长也具有强烈的抑制作用。利用PCR法从人胎肝cDNA文库中克隆了人血管内皮抑素的编码序列，构建了重组质粒pRSendo，并在E.coli中表达，SDS－PAGE表明其表达产物为包涵体，此外，还对血管内皮抑素做了初步的纯化。     

转人Cu,Zn-SOD基因马铃薯的研究

采用RT—PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了490bp的人铜锌超氧化物歧化酶(hCM，Zn—SOD)基因的cDNA序列，进行了序列测定，结果和文献报道的一致；构建了CaMv35S启动子驱动hCu，Zn—SOD基因的植物表达载体PBICuSOD；用三亲交配法将重组质粒PBICuSOD转化到农杆菌LBA4404，转化马铃薯得到转基因植株。PCR和Southern—blot分析证明，hCu，Zn—SOD基因巳整合到马铃薯基因组中。Western blot分析表明，hCu，Zn—SOD基因在转基因马铃薯植株中得到表达。用NBT光还原法测定转基因马铃薯植株中的SOD酶活力，叶的总酶活为1066．6U／g(湿重，下同)，块茎的总酶活为10llU／g。     

蛋白磷酸酶2C（PP2C）的表达、 纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA, 经RT PCR, 扩增出蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因, 并构建了pUCm T载体. 经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后, 将pUCm T中的PP2C基因插入pET28a载体中, 构建了表达载体pET28a PP2C, 并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达. 经测定, 该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为： 诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L, 37 ℃, 诱导时间为20 h. 在此条件下, PP2C实现了高 效表达, 表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%, 其中在裂解上清液、 沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%. 经SDS PAGE分析, 表达产物分子量约为42 000. 应用Ni NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化, 收率达805%, 纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.     

人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ Ｈ Ｉ Ｖ２） 的原病毒基因组为模板,通过套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增得到了 Ｈ Ｉ Ｖ２ 的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｘ５ Ｘ１ ,获得了重组表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ３６ Ｅ Ｎ Ｖ． Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 对重组表达菌株诱导后, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生     

重组人尿激酶原基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT－PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因,用表达质粒pET29a构建了重组质粒pET29a/prouk,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,作为工程菌。经IPTG诱导表达,在46kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％。该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性。     

Bti cryIVB基因的克隆及表达质粒的构建

采用ＰＣＲ方法,克隆得到３．５ｋｂ的开放阅读框架（ＯＲＦ）,其包括Ｂｔｉ的杀虫蛋白基因,ｃｒｙＩＶＢ结构基因各部分上游启动区。将结构基因亚克隆到高表达载体ｐＱＥ５２中,构建了高表达质粒ｐＱＥ５２Ｂ。在Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ）中,１３０ｋＤ的蛋白得到表达,其对韭菜迟眼蕈蚊（Ｂｒａｄｙｓｉａ ｏｄｏｒｉｐｈａｇａ）三龄幼虫具有较强的毒杀作用。     

含内蛋白子融合表达载体的构建与人神经营养因子-3的初步表达

为了构建一个含蛋白质剪接元件的表达载体 ,将 3.38kb的 p Ex Sec 的多克隆位点 (Eco R /Bam H )处插入一个含多个酶切位点的 49bp寡聚核苷酸。然后将 p MYB12 9中 intein- CBD基因片段移插入上述经改造的p Ex Sec I中 ,构建成含内蛋白子的表达载体 p Ex IC。根据人神经营养因子 - 3(h NT- 3)的已知 DNA序列 ,设计含 NdeI/Xho I酶切位点的引物 ,用 PCR法从人全血总 DNA中扩增 h NT- 3,再插入 p Ex IC载体中 ,构建成 p Ex IC- h NT- 3重组质粒。经转化后 ,工程菌 E.coli BL 2 1(DE3) /p Ex IC- h NT- 3在 L B培养基中获得融合表达 ,根据 intein的自剪切原理 ,在还原剂 DTT作用下 ,初步获得了约 14k D的 h NT- 3目的蛋白。