重组胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养;利用Western blotting进行发酵产物鉴定. 摇瓶培养最优条件:10%接种量、25 mL LB培养基、37 ℃培养, 0.02 g/mL的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3h后目的蛋白表达量最高. BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到3L发酵培养基中,设定溶氧40%,pH7.0,温度37 ℃,通气量3 L/min,快速流加甘油60 g ,培养4 h后,加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3 h后终止发酵. 发酵罐中获得的菌体量为36 g/L,蛋白表达率为10%左右.     

鲨鱼软骨活性段蛋白在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索菌种BL21（DE3）/pET3C-aSCAIF表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养.摇瓶培养最优条件：2%接种量、25 mL LB培养基、37℃培养、0.5%的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高.菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为：以10%的接种量接种到2.5 L发酵培养基中,设定溶氧30%,pH7.0,温度37℃,通气量3 L/min,流加甘油15 g,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后终止发酵,发酵罐中获得的菌体量为62.1 g.     

致病性鸡大肠杆菌pilA和外膜蛋白C原核诱导表达条件的优化

分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等条件对2种重组菌株BL21/pET - 28a - pilA和BL21/pET - 28a - ompC进行优化.得到最佳诱导条件:BL21/pET - 28a - pilA菌株为40℃摇培,80μL的接菌量,160r/min摇培2h后加入终浓度为0.96mmol/L的IPTG,再诱导表达4h,得到最高特异蛋白表达量;BL21/pET - 28a - ompC菌株为37℃培养,80μL的接菌量,160r/min摇培2.5h后加入终浓度为0.64mmol/L的IPTG,再诱导表达6h,得到最高特异蛋白表达量.     

大肠杆菌表达高性能融合鱿鱼环齿-类弹性蛋白的发酵优化

为了实现重组蛋白SRT-ELP36在大肠杆菌中的高效表达,利用携带重组蛋白SRTELP36基因的pET-25b(+)表达载体,分别在摇瓶和5 L发酵罐上进行了发酵条件优化,并在50 L发酵罐中进行放大验证。经转化表达质粒后,宿主菌BL21(DE3)的菌体生长和蛋白体积产量均高于BLR(DE3),可用于蛋白SRT-ELP36表达。摇瓶发酵条件优化结果表明,TB(Terrific Broth)培养基、装液比(装液量与摇瓶体积之比)为5%、诱导温度为37℃、对数生长结束期添加0.5 mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂,菌体最高OD₆₀₀(波长600 nm处的吸光值)达到22.3,最高蛋白体积产量达0.60 g/L。在5 L发酵罐中进行补料分批培养条件优化,在OD₆₀₀为35时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG启动诱导,并控制过程菌体氧消耗速率(OUR)为(180±5) mmol/(L·h),菌体的最高OD₆₀₀和蛋白体积产量分别达到了88、1.85 g/L,单位菌体蛋白产量为70 mg/g。在...     

重组谷氨酰胺转胺酶基因的原核表达研究

采用基因重组手段构建了含重组谷氨酰胺转胺酶基因的菌株E.coli BL21/pET30α-MTG(DE3).研究了诱导剂浓度、诱导时间、温度和转数等对重组体表达的影响,确定了融合蛋白pET30α-MTG的最佳表达条件. 结果表明:当摇菌转速250 r/min,IPTG终浓度1.0 mmol/L,温度37 ℃时,诱导培养4 h可得最大表达量.     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表达条件优化

采用RT-PCR技术从番茄中扩增谷光甘肽转移酶基因ShGSTU1,构建该基因的原核表达载体pET28aShGSTU1和pET32a-ShGSTU1,并对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达条件进行优化,主要对诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度进行分析.结果表明:重组蛋白在表达载体pET28a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,37℃诱导4h;在表达载体pET32a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,30℃诱导5h.     

重组大肠杆菌DH5α生产rhTum-5-NGR培养条件的优化

目的提高重组大肠杆菌DH5α生产rhTum-5-NGR的能力。方法在摇瓶中研究了种子菌龄、接种量和诱导时机等因素对菌体生长及rhTum-5-NGR表达量的影响。结果最佳条件为接种量2%,初始pH为7.2,装液量30%,37℃培养至OD_(600)为2.3左右时加入0.5mmol/L IPTG,诱导表达4h。在此条件下,摇瓶中rhTum-5-NGR的表达量占菌体总蛋白的40.1%,光密度为5.94,生产能力为2.38,较优化前(0.82)提高了1.9倍。结论构建的工程菌发酵的稳定性和重复性良好,为肿瘤新药rhTum-5-NGR的工业化生产奠定基础。     

产菊酯降解酶重组菌的高密度发酵工艺优化

为提高菊酯降解酶的产量,利用单因素和正交实验法对重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-sys410的发酵培养基组成和发酵条件进行优化。结果显示最优培养基含有20.0 g·L-1甘油、20.0 g·L-1酵母粉、8.0 g·L-1硫酸铵、100.0 mmol·L-1磷酸盐、5.0 mmol·L-1硫酸镁,以及1.5 m L·L-1的微量元素;发酵条件为装液量50 m L/250 m L、初始培养基pH 7.0、接种量2%,接种培养8 h后乳糖诱导6 h。在7.5 L发酵罐上,使用低浓度碳氮源进行培养,前期恒速补料,对数中后期进行乳糖诱导,后期恒溶氧补料,最终菌体密度和酶活力分别为142.6和3 105.1 U·m L-1,较摇瓶发酵分别提高13.7倍和31.9倍。发酵液经破碎和冷冻干燥后酶活力达到119 426.9 U·g-1,且该酶对菊酯的降解率高于95%。     

人Sox2基因的克隆表达和纯化

应用RT-PCR方法从人胚胎十细胞中扩增出Sox2基因,构建pET28b-Sox2表达载体.用IPTG诱导转化pET28b-Sox2表达载体的大肠杆菌BL21(DE3).并优化表达条件为37℃ 1PTG0.8 mmol/L诱导4 h.以Ni-NTA亲和层析法纯化Sox2重组蛋白,对变性蛋白进行柱上和透析复性,复性后蛋白得率为0.7 mg/g湿菌重.     

海带热休克蛋白70基因体外原核表达研究

在前期研究克隆得到全长海带HSP70基因的基础上,为进一步研究藻类HSP70的生物学功能,将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。     

亮氨酸拉链结构蛋白在大肠杆菌重组子中的表达

酵母转录因子GCN4是通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质之一，当GCN4二聚体与DNA结合时，亮氨酸拉链区的2个单体结合为平行的卷曲螺旋结构，而其基区由无规线团结构变为α螺旋．为探讨亮氨酸拉链蛋白与DNA的结合机理，设计了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA的必需氨基酸的折叠片段，并将其克隆到Escherichia coli BL21，讨论了此亮氨酸拉链蛋白的表达条件．在蛋白质的小量表达试验中，重组子Escherichia coli BL21于5mL含有50μg／mL氨节青霉素和34μg／mL氯霉素的LB液体培养基中培养至对数期，加入不同浓度的IPTG，继续培养以诱导蛋白质的表达，在不同的时间(如：诱导前，诱导2，4，6，8h)取样100μL到1．5mL离心管中、离心收集沉淀，将沉淀悬浮于样品缓冲液中，用10％SDS-PAGE检测；在10L含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中进行了大量表达，根据小量表达的试验结果确定了IPTG的浓度和诱导时间．结果表明：含有这种拉链蛋白质的重组子Escherichia coli BL21在37℃下小量培养时，0．1-0．8mmol的IPTG均可在2-10h内诱导该蛋白质表达；而大量培养时，0．2mmol和0．4mmol的IPTG在37℃均不可能诱导表达，只在28℃时才表达；小量培养和大量培养的最佳诱导时间为4-6h，诱导剂IPTG的浓度为0．2mmol，大量表达的温度为28℃而不是37℃．     

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

重组人附睾特异蛋白BDFx的优化表达与纯化

通过改变异丙醇-β-D硫代半乳糖苷诱导浓度、诱导温度及诱导培养时间,优化含重组人附睾特异蛋白BDFx工程菌的表达条件．运用DEAE阴离子与CM阳离子交换层析及S-100分子筛层析纯化重组蛋白,用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描等方法鉴定目的蛋白．结果显示,缩短诱导培养时间、降低IPTG浓度等可提高重组蛋白的表达量,表明适当提高诱导表达温度不会形成包涵体,并可缩短表达时间．     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白的优化表达

研究培养基成份、pH值、接种量、诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平的影响.SDS-PAGE电泳分析结果表明:在37℃的LB培养基中培养3h,用终浓度为0.3mmoL/L的IPTG于30℃诱导5h时表达水平最高.苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64重组蛋白在大肠杆菌中的优化表达为深度解析其在病毒感染过程中的功能奠定了基础.     

乳糖诱导mIL-9蛋白高效表达研究

研究了乳糖诱导重组工程菌pET(32a+)-rmIL-9/BL21(DE3)高效表达rmIL-9融合蛋白的实验条件,探讨规模化生产rmIL-9的可行性.分别考察乳糖诱导时机、诱导浓度、诱导时间等参数对rmIL-9融合蛋白表达的影响,并通过正交实验,筛选最佳的乳糖诱导条件.结果显示,对于rmIL-9融合蛋白,乳糖作为诱导剂可达到良好的诱导效果,诱导产物的表达量可优于IPTG诱导产物.最优诱导表达条件为:当菌液OD600值为1时,添加终浓度为5g/L的乳糖,诱导9 h可以高效表达目的蛋白.实验表明,采用乳糖可以诱导rmIL-9融合蛋白基因的高效表达,此为动物实验评价rmIL-9治疗黑色素瘤提供了前期基础.     

集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆、优化表达及其结构功能预测

从集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803提取总DNA,利用PCR扩增目的基因sll0853,构建重组T-0853克隆载体和pET-0853原核表达载体.为了提高sll0853在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明sll0853基因蛋白表达的最佳条件.结果表明:目的蛋白在28℃、0.2mmol/L IPTG、诱导6h表达量分别达高峰.通过生物信息学软件预测基因sll0853可能具有裂合酶的功能.     

麻疯树逆境蛋白(curcin 2)基因的原核表达

将编码麻疯树逆境蛋白curcin 2成熟蛋白的M片段和编码前体蛋白的P片段分别定向克隆到质粒载体pQE-30、pQE-31后,获得重组质粒pQE-30-M、pQE-31-P.该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株,经IPTG诱导后M片段表达的蛋白质主要以包涵体形式存在,蛋白质的表达量与IPTG浓度及诱导时间有关.重组蛋白可与RGS-His抗体及curcin抗体分别发生专一性抗原抗体反应并被His TrapTMHP柱亲和纯化.体外抗真菌活性实验表明,复性处理后的curcin 2融合蛋白使玉米弯胞杆菌[Curvul     

中国明对虾ALFFc基因的原核表达与抗血清制备

利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术克隆了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗脂多糖因子(ALFFc)基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-ALFFc原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)筛选法获得了1株高表达量重组菌,并通过实验确定其最佳诱导条件为:菌液初始OD6000.7,IPTG终浓度0.8 mmol/L,培养温度37℃,诱导时间3 h.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,为进一步研究ALFFc的功能奠定了基础.     

猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。