高效液相色谱法测定制剂中生长抑素的含量

介绍了一种用高效液相色谱法测定制剂中生长抑素含量的新方法,该法测定准确,操作简便,重现性好.     

荧光定量PCR技术研究壳寡糖对A549细胞 cyclin D1, bcl-xl和bcl-2 mRNA表达的影响

壳寡糖(Chitooligosaccharide, COS)是壳聚糖的水解产物, 除具有抗菌、抗氧化、促细胞分化、促进骨折愈合等多种生物功能外, 还具有抗肿瘤的作用, 但其中作用机制还不清楚. 以5种壳寡糖低聚物(壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖)为研究对象, 通过荧光定量PCR技术, 研究它们对A549细胞cyclin D1 和bcl-2, bcl-xl mRNA表达的影响. 结果显示在这5种低聚物中, 壳六糖抑制A549细胞增殖的作用最为明显, 同时壳六糖还下调cyclin D1 和bcl-xl mRNA的表达, 说明壳六糖可能通过两种不同的机制发挥其抗肿瘤特性: (1) 壳六糖可以抑制Cyclin D1水平, 从而抑制肿瘤细胞的增殖; (2) 壳六糖通过下调抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达以促进肿瘤细胞的凋亡.     

2-乙基-3-羟基-6-苯硫基-4(1H)-吡啶酮对自由基的清除和抑制作用

研究2-乙基-3-羟基-6-苯硫基-4(1n)-吡啶酮(HPP)对羟自由基和超氧阴离子自由基的影响．用荧光分光光度计测定Fenton反应产生的羟自由基的清除率和生成抑制率，用比色法测定黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系和大鼠腹腔多型核白细胞呼吸爆发产生的超氧阴离子自由基的清除率．HPP对Fenton反应产生的自由基有显的清除和抑制作用，且活性比羟自由基的特异性清除剂甘露醇强，对化学反应和大鼠腹腔多型核白细胞呼吸爆发产生的超氧阴离子自由基也有明显的清除作用，且活性较维生素E稍强．可见HPP是一种良好的氧自由基清除剂。     

bFGF在原代培养人皮肤成纤维细胞中的高效分泌表达

目的：提高碱性成纤维细胞生长因子在原代培养的成纤维细胞中的分泌表达。方法：bFGF缺乏典型的分泌信号肽,将鼠抗体轻链基因Igx的信号肽序列引入该基因的5′端得到新的IgK-bFGF重组体基因。同时考虑到人源细胞氨基酸编码密码子的偏好性,对整个基因序列密码子的第3位摇摆碱基作了偏好性调整,并克隆入真核表达载体中。得到的重组质粒用酶切的方法线性化,尽量去除质粒载体上大肠杆菌起源的基因序列,然后通过电穿孔的方法将线性质粒转导入原代培养的人皮肤成纤维细胞。结果：与野生型的bFGF基因相比,嵌合体bFGF被大量分泌到培养基中,同时对于成纤维细胞的增殖有明显的促进作用。结论：这种嵌合体基因的构建可以明显提高成纤维细胞对bFGF。的分泌表达。     

鲨鱼软骨活性段蛋白在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索菌种BL21（DE3）/pET3C-aSCAIF表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养.摇瓶培养最优条件：2%接种量、25 mL LB培养基、37℃培养、0.5%的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高.菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为：以10%的接种量接种到2.5 L发酵培养基中,设定溶氧30%,pH7.0,温度37℃,通气量3 L/min,流加甘油15 g,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导4 h后终止发酵,发酵罐中获得的菌体量为62.1 g.     

应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法

介绍一种采用实时荧光定量PCR法鉴定重组细胞株基因组中外源基因拷贝数的方法.首先根据研究对象建立标准品,以拟检测的外源基因设计特定的引物,得出标准曲线,然后在不同重组细胞株中对外源基因进行Real-Time PCR鉴定,根据结果与标准品比对得出实际的拷贝数.结果表明:以转染sPDGFRα基因的重组CHO-K1细胞为例,采用该方法,利用标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系,并且具有较大的线性范围(101-105拷贝);测得各重组细胞株外源基因拷贝数不同,3次独立实验表明结果一致.与传统杂交技术鉴定转基因拷贝数相比,该方法具有高效省时、更稳定、高通量和低成本等优点.     

TIR突变的hbFGF在原核系统中高效的表达

目的：为获得非融合高表达hbFGF的大肠杆菌表达系统；方法：设计PCR引物，将hbFGF的5’端前10个密码子突变，优选大肠杆菌较偏好的密码子并降低G C含量，通过双酶切法将突变后的hbFGF克隆人pBV220质粒载体中，筛选出重组子，再通过温控法对重组菌体进行诱导，分析表达情况，并进一步纯化和测活；结果：bFGF在该系统中高水平表达，表达量超过30％，其中绝大部分形成包涵体，经过包涵体变复性等纯化步骤后测活性，证明有生物活性；结论：TIR区域的基因突变对hbFGF在pBV220中高效表达起到关键作用。