MicroRNA-122过表达转基因小鼠的建立

目的:建立microRNA-122 (mir-122)过表达转基因小鼠模型,为今后研究肝脏发育,分化及肝癌预防、诊断及治疗等提供实验模型.方法:构建mir-122过表达载体,利用受精卵前核显微注射法将mir-122过表达载体导入小鼠受精卵中,获得mir-122过表达转基因小鼠.PCR法检测转基因小鼠的整合情况,实时定量PCR法检测mir-122过表达转基因小鼠肝脏及其主要器官mir-122及其确定靶基因高亲和性阳离子氨基酸转运体-1(CAT-1),切割同源物1(CUTL-1),血清反应因子(SRF)的表达情况.结果:mir-122过表达转基因小鼠,与同窝阴性鼠相比,mir-122在过表达转基因小鼠肝脏及主要器官中的表达升高,mir-122靶基因表达水平下降.结论:成功构建mir-122过表达转基因小鼠.     

重组碱性成纤维细胞生长因子对β-演粉样蛋白诱导新生大鼠海马神经细胞凋亡的抑制作用

目的探索不同剂量重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导的海马神经细胞凋亡的抑制作用及治疗老年性痴呆(AD)的可能机制.方法分离培养新生大鼠海马组织神经细胞,用Aβ25-35诱导分化成熟的海马神经细胞凋亡,采用Hoechst33258染色法、Annexin-V法、脱氧核糖核酸琼脂糖凝胶电泳、蛋白质杂交技术研究加入Aβ25-35培养的以及Aβ25-35和bFGF共培养的海马神经细胞的形态和分子生物学改变及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的变化.结果Aβ25-35可诱导海马神经细胞核脱氧核糖核酸发生降解,出现胞浆浓缩、凋亡小体形成等;而Aβ25-35和bFGF共培养的海马神经细胞则能缓解这种形态学上的变化,细胞凋亡率减少,Bcl-2的表达量上调而Bax表达量下调.结论bFGF能抑制Aβ25-35对神经细胞的毒性作用,其机制可能是通过调控Bcl-2、Bax的表达来实现的.     

bFGF在原代培养人皮肤成纤维细胞中的高效分泌表达

目的：提高碱性成纤维细胞生长因子在原代培养的成纤维细胞中的分泌表达。方法：bFGF缺乏典型的分泌信号肽,将鼠抗体轻链基因Igx的信号肽序列引入该基因的5′端得到新的IgK-bFGF重组体基因。同时考虑到人源细胞氨基酸编码密码子的偏好性,对整个基因序列密码子的第3位摇摆碱基作了偏好性调整,并克隆入真核表达载体中。得到的重组质粒用酶切的方法线性化,尽量去除质粒载体上大肠杆菌起源的基因序列,然后通过电穿孔的方法将线性质粒转导入原代培养的人皮肤成纤维细胞。结果：与野生型的bFGF基因相比,嵌合体bFGF被大量分泌到培养基中,同时对于成纤维细胞的增殖有明显的促进作用。结论：这种嵌合体基因的构建可以明显提高成纤维细胞对bFGF。的分泌表达。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化及生物活性鉴定

目的 :探讨重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rhbFGF)的纯化工艺和活性鉴定 .方法 :将rhbFGF工程菌大量扩增后通过包涵体提取、复性、阳离子交换、凝胶过滤等技术进行纯化 .结果 :纯化后的rhbFGF ,相对分子质量为 17× 10 3,蛋白纯度为 95 %以上 ,比活为 1 7× 10 6 U/mg ,对NIH3T3细胞具有明显的促分裂活性 .结论 :通过复性和两步层析的纯化方法可获得高纯度、高回收率和高生物活性的rhbFGF ,可用于实验室研究及临床试验     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

重组大肠杆菌高效表达hbFGF的培养条件

对工程菌hbFGF/BL21(DE3)pLysS高效表达hbFGF的培养条件的研究结果表明，接种量（ψ）为5％，当培养液菌体浓度为0.8OD600时，添加0.5mmol/L诱导剂IPTG可以获得较高的hbFGF表达量，30％的溶解氧和较低的醋酸浓度有利于hbFGF的表达。     

重组碱性成纤维细胞生长因子对β-淀粉样蛋白诱导新生大鼠海马神经细胞凋亡的抑制作用

目的：探索不同剂量重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导的海马神经细胞凋亡的抑制作用及治疗老年性痴呆(AD)的可能机制。方法：分离培养新生大鼠海马组织神经细胞，用Aβ25-35诱导分化成熟的海马神经细胞凋亡，采用Hoechst33258染色法、Annexin-V法、脱氧核糖核酸琼脂糖凝胶电泳、蛋白质杂交技术研究加入Aβ25-35培养的以及Aβ25-35和bFGF、共培养的海马神经细胞的形态和分子生物学改变及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的变化。结果：Aβ25-35可诱导海马神经细胞核脱氧核糖核酸发生降解，出现胞浆浓缩、凋亡小体形成等；而Aβ25-35和bFGF共培养的海马神经细胞则能缓解这种形态学上的变化，细胞凋亡率减少，Bcl-2的表达量上调而Bax表达量下调。结论：bFGF能抑制Aβ25-35对神经细胞的毒性作用，其机制可能是通过调控Bcl-2、Bax的表达来实现的。     

2-乙基-3-羟基-6-苯硫基-4(1H)-吡啶酮对动物实验性急性肝损伤的保护作用

目的 :研究 2 -乙基 - 3-羟基 - 6-苯硫基 - 4 ( 1H) -吡啶酮 (HPP)对四氯化碳 (CCl4 )、硫代乙酰胺 (TAA)及D -氨基半乳糖 (D -GalN)引发的小鼠急性肝损伤的影响 .方法 :用CCl4 、TAA、D -GalN引发动物急性肝损伤 ,HPP通过口服给药 ,测定动物血清中谷丙转氨酶 (GPT)、谷草转氨酶 (GOT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH -Px)、超氧化物歧化酶 (SOD)的活性 ,用硫代巴比妥酸法测定肝组织中丙二醛 (MDA)含量 .结果 :HPP 1.6mg·kg- 1、6.4mg·kg- 1显著抑制动物血清中GPT、GOT活性的升高 ,显著抑制GSH -Px ,SOD活性的降低且能降低肝组织中脂质过氧化产物MDA含量的升高 ,同时HPP对CCl4 所致大鼠急性肝损伤也有一定的抑制作用 ,实验表明HPP对正常小鼠血清及肝脏GPT活力无明显影响 .结论 :HPP对动物急性肝损伤有明显的抑制作用     

TIR突变的hbFGF在原核系统中高效的表达

目的：为获得非融合高表达hbFGF的大肠杆菌表达系统；方法：设计PCR引物，将hbFGF的5’端前10个密码子突变，优选大肠杆菌较偏好的密码子并降低G C含量，通过双酶切法将突变后的hbFGF克隆人pBV220质粒载体中，筛选出重组子，再通过温控法对重组菌体进行诱导，分析表达情况，并进一步纯化和测活；结果：bFGF在该系统中高水平表达，表达量超过30％，其中绝大部分形成包涵体，经过包涵体变复性等纯化步骤后测活性，证明有生物活性；结论：TIR区域的基因突变对hbFGF在pBV220中高效表达起到关键作用。