生物信息学技术克隆并分析新基因STRF7

为进一步研究信号转导相关的新基因片段BE644250,采用生物信息学方法克隆基全长cDNA,并分析了其ORF,电子表达谱,染色体定位等,之后对全长序列进行了实验验证。电子延伸（contig)获得了729bp的延伸产物,含一个典型的74aa的ORF,命名为STRF7。与已知蛋白无明显同源性,部分地相似于人的源框蛋白CDX－4和酵母的转录调节子ADR6,属一新发现的基因;RT－PCR从IL－6刺激后的U937中克隆了STRF7基因,基序列与电子延伸结果安全一致,进一步的分析显示STRF7在多种组织中表达并定位于第6号染色体上,上述结果显示,STRF7是一个新基因,编码含74aa的蛋白,并且是一个潜在的转录因子。     

人spindlin 1基因全长cDNA的克隆与定位

利用分子克隆技术和生物信息学手段,克隆并命名了人spindlin 1 基因. 此基因cDNA全长4375?bp,含有236～949 bp完整开放读框,预测编码27?ku 的膜内蛋白. 新基因在核酸序列上与鼠spindlin基因有96%同源,其编码氨基酸序列与鼠spindlin蛋白98%同源. 生物信息学分析表明该基因定位于9q22.1-22.3 区域, 基因组DNA全长为52.3?kb,由5个外显子和4个内含子组成,内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AG法则. 利用绿色荧光蛋白与spindlin 1基因的融合蛋白表达载体转染COS-7细胞表明spindlin 1表达的蛋白定位于胞核,且转染后的细胞中较多见胞核形态的改变,例如出现双核或巨型核.     

一个犬凝集素基因VIP36的人类同源基因cDNA的克隆、染色体定位和表达谱分析

从人的胎脑cDNA文库中克隆到一条犬凝集素基因VIP36的人类同源基因,此cDNA序列全长2430bp,拟编码一个382个氨基酸残基的蛋白,它编码的蛋白与犬VIP36有52％的同源性,因此将其命名为人类VIP36L基因,应用辐射杂交方法,钭该基因定位在人2号染色体的分子标记D2S388和D2S113之间,采用基因芯片杂交的方法研究其表达谱情况,发现该基因在胎皮和肝癌组织中表达量较高。     

眼斑拟石首鱼肽聚糖识别蛋白2的基因克隆与组织表达特性

采用同源克隆技术获得了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的肽聚糖识别蛋白2基因(命名为So-pglyrp2).So-pglyrp2的cDNA全长1 729 bp,含有1个1 446 bp的开放阅读框,编码的482 aa前体蛋白带有1个21 aa信号肽;So-pglyrp2基因由4个外显子和3个内含子构成.序列比对分析表明,So-pglyrp2存在1个保守的PGRP结构域,其氨基酸序列与已报道的脊椎动物pglyrp2的同源性最高,一致性为57.1%~82.8%.RT-PCR分析表明,So-pglyrp2基因在肝脏强烈表达,在性腺、肠和胃组织弱表达,在其他组织不表达.研究结果为阐明鱼类pglyrp2基因结构、了解低等脊椎动物pglyrp2的进化地位、探讨鱼类pglyrp2的免疫学功能奠定了坚实的基础.     

蜡梅热激蛋白基因 Cp HSP70-1的克隆、亚细胞定位与表达分析

在已构建的蜡梅花转录组数据库EST序列分析的基础上,采用 RACE技术克隆获得蜡梅热激蛋白 HSP70的cDNA序列,命名为CpHSP70‐1（GenBank登录号：KR071130）．该序列全长2520 bp ,包括1962 bp的完整开放阅读框,编码653个氨基酸蛋白序列,含有3个 HSP70家族典型基序．CpHS P70‐1蛋白与其他真核生物的HSP70蛋白具有较高的同源性,聚类分析显示其属于定位于细胞核／细胞质的蛋白．亚细胞定位结果支持该蛋白分布于细胞核的预测．利用实时荧光定量PCR对 CpHS P70‐1基因的表达特性进行分析,其在各组织中均有不同程度的表达,其中在成熟叶片中表达量最高;在不同花发育阶段呈现持续稳定的表达模式;该基因在低温和高温诱导下表达量提高,而且对高温的响应更为敏感．     

人酪蛋白激酶CK1γ1 cDNA的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

从人胎脑cDNA文库中克隆到一种新的酪蛋白激酶的cDNA，全长1754dp，拟编码438个氨基酸残基，该蛋白预测的分子质量为50272u，等电点9．37，经同源分析，该基因在大鼠的CK1γ1蛋白有94％的相似性，为人1型酪蛋白激酶－γ1亚型基因，人CK1γ1基因同时与15号与17号染色体的基因组部分序列完全一致，但RH法却将基因定位于15q22区段的D15S159－D15S125 Marker之间，多组织Northern膜（MTN）杂交分析显示，人CK1γ1基因在肝，结肠，肾和骨骼肌特别在肝组织中有高表达。     

MAGE家族新成员Restin入核分子机制的初步探讨

restin是该实验室于1999年从维甲酸诱导分化的白血病细胞HL-60中克隆得到的一种黑色素瘤相关抗原（MAGE）家族的新基因，初步验证其生物学功能为阻滞细胞周期进程。利用生物学软件预测该基因所编码蛋白的N端含有一非典型二分裂核定位信号序列（nuclear localization signal，NLS），且预测结果显示Reslin入核可能与核转运蛋白imponjn αⅡ的作用密切相关。因此克隆并鉴定了针对NLS等结构域的一系列截短体以及pACT—impotin α Ⅱ，利用细胞双杂交技术对其进行相互作用以及作用部位的检测。结果证明Restin的入核确实与核定位信号序列以及核转运蛋白的相互作用有关。     

美容杜鹃RcHsfB3基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE方法从美容杜鹃(Rhododendron calophytum)中克隆到一个热激转录因子(Heat shock factors,Hsfs),命名为RcHsfB3(GenBank登录号KU145694).RcHsfB3基因全长1130bp,完整的开放读码框(ORF)长771bp,预测可编码257个氨基酸,分子量为28.8KD,等电点为5.38.系统进化树分析发现,该基因与其它几种植物的HsfB3基因属于同一分支,氨基酸同源序列比对结果表明RcHsfB3与葡萄的VvHsfB3的同源性最高,达67.29%.原生质体亚细胞定位表明,RcHsfB3编码蛋白定位在细胞核上.荧光定量PCR分析显示,美容杜鹃分别受到热激、低温和盐害胁迫处理后,RcHsfB3的相对表达量总体呈现先上升,后下降,且"上升-下降"交替的表达趋势.初步研究表明RcHsfB3基因受高温、低温和高盐胁迫的诱导表达.     

一条在人睾丸中高表达的新的环指蛋白(RNF20)

从人胎脑构建的cDNA文库中,通过大规模测序筛选的方法获得一条新基因,该基因蛋白序列含有1个环指（RING finger)基序及2个进核信号（nuclear localization signal NLS)序列,钭此基因命名为RNF20（RING Finger 20),用放射杂交细胞系（Radial hybrid RH)方法定位此基因在人染色体的9q22上,Northern杂交表明,其mRNA在睾丸组织中高表达,用小鼠睾丸做原位杂交表明,小鼠的同源基因在精原细胞及初级精母细胞中高表达,未成年小鼠睾丸中的精原细胞没有发达,提示RNF20可能参与精子发生的调控作用。     

SLC38A3抗体的制备及细胞内定位

从人胎肝cDNA文库中钓取得到SLC38A3全长cDNA序列.利用生物信息学方法对SLC38A3蛋白序列进行分析,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择一段多肽序列作为抗原用于抗体制备.将该片段克隆到pET-DsbA融合蛋白表达载体上,在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下产生SLC38A3抗原肽.纯化目的蛋白并制备兔抗SLC38A3蛋白的多克隆抗体.利用Western blot鉴定抗体特异性,并初步分析该蛋白在人肺癌细胞A549内的定位.结果显示,成功构建了SLC38A3片段的原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,制备了特异性较高的人SLC38A3蛋白多克隆抗体,并证实该蛋白表达于细胞质内.为进一步研究SLC38A3的生物学功能奠定了基础.     

砷代谢相关的全长新cDNA的克隆和功能初步研究

从人胎脑中获得mRNA建立cDNA文库,通过大规模测序克隆出一人类新基因cDNA,全长2255bp,开放阅读框（ORF）1532bp,用4umol/砷刺激L－02细胞2周,与未用砷刺激的L－02细胞作表达谱基因芯片杂交,发现该基因在胂刺激L－02细胞中表达量上调3倍,用不同浓度砷染毒L－02细胞2周,与未用砷染毒辣的L－02细胞抽RNA转膜作Northern杂交,结果显示文艺基因在未染毒L－02名几乎不表达;而在砷染毒细胞中该基因的表达量明显增加,且有随剂量增加表达量亦增加的趋势;同时Northern结果显示在2,3kb处有单一条带,用不同浓度砷染毒L－02细胞2周,作细胞原位杂交,结果显示该基因在未染毒细胞中几乎不表达,在各染毒组细胞中均有表达,据此,认为这可能是一条新的全长砷代谢相关基因,经HUGO／GDB人类基因命名委员会的同意,命名为ARGI（arsenite related gene 1)。     

Microarray-Based Differential Expression Monitoring of 79 Novel Genes in Human Fetal Tissues

0　ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＬａｒｇｅ ｓｃａｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ(ＥＳＴ)ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｌｅｄｔｏｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｎｄｒｅｄｓａｎｄｔｈｏｕｓａｎｄｓｏｆｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｍｉｃｒｏｂｅｓｔｏｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒｅｕｋａｒｙｏｔｅｓａｎｄｐｌａｎｔｓ[1,2 ] .ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅａｃｈｋｎｏｗｎｇｅｎｅｏｒＥＳＴｕｓｉ…     

Cloning and expression analysis of MBLL cDNA

The mbl (muscleblind) gene of Drosophila encodes a nuclear protein which contains two Cys3His motifs. The mutation of mbl gene will disturb the differentiation of all the Drosophila's photoreceptors. Primers have been designed according to human EST086139, which is highly homologous to mbl gene. Human fetal brain cDNA library has been screened and a novel cDNA clone has been obtained. The 2595 bp cDNA, designated MBLL (muscleblind-like), contains an open reading frame which encodes 255 amino acids and has 4 Cys3His motifs (GenBank Acc. AF061261). The amino acids sequence shares high homology to Drosophila's mbl. The Northern blot and RNA dot blot hybridization of 43 human adult tissues and 7 fetal tissues show that MBLL is a widely expressed gene, but the expression amounts differ in these tissues.     

人类Neuritin cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库筛选出一条1618bp的cDNA。此cDNA含有一个426bp的最大开放阅读框,编码一个142个氨基酸的蛋白质,预测分子质量为15.3ku。与目前数据库中序列比较,该cDNA与鼠neuritin基因同源性达98％。多组织Northern blot分析显示neuritin在脑组织高度表达。neuritin cDNA的读框片段正确插入到pQE40表达载体中,获得了预期的表达产物,并初步得到了其纯化蛋白。     

新的人羧肽酶A抑制物cDNA的克隆、定位和表达谱分析

从人的胎脑cDNA文库中,克隆到一条全新的人类羧肽酶A抑制物基因,此cDNA序列全长1049bp,包括翻译起始位点附近的Kozak序列,669bp 的开放读框以及3端的加尾信号,共编码222个氨基酸,它编码的蛋白与小鼠Latexin蛋白和大鼠Latexin蛋白分别有高达85％和84％的同源性,因此命名为人类LATEXIN基因,应用辐射杂交方法,将该基因伫位在人3号染色体3q24区段,位于分子标记D3S1605和D3S1553之间,采用基因芯片杂交的方法研究其在某些组织或细胞中的表达情况,发现在前列腺癌中表达量较高。     

人Rab蛋白cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库中克隆到一种新的Rab cDNA,全长920bp,以编码213个氨基酸残基,该蛋白预测的分子质量为24567u,等电点7．34,经同源比较,该cDNA与GenBank数据库中登录号为X14964的Rab蛋白有83％的相似性和76％的相同性,将该cDNA克隆到经改造的PBV220表达质粒,转化DH5a菌株诱导表达出该蛋白,取24种不同组织的总cDNA各100ng,用该基因序列设计引物作PCR,结果在胎肝组织中检测到有明显条带,表明该Rab基因相对在胎肝有高表达。     

一个新C2H2型锌指蛋白的功能的初步研究

通过筛选人18周胎脑cDNA文库,得到一条编码332AA的全长新基因,生物信息学研究表明,该蛋白质序列有2个C2H2型锌指结构,其中1个锌指结构有RNA－binding蛋白特异锌指的特征,虽然同源比较发现与多种蛋白质精氨酸N端转甲基酶（protein arginine N-methyltransferase) 有一定的同源性,但新锌指蛋白不含转甲基酶的活性功能区域,属功能未知的基因,利用芯片研究功能未知基因的表达是一种较好的手段,通过代谢增强剂PMA（phorbol myristae acetate)刺激培养的血管内皮细胞,观察细胞受激活后新锌指蛋白基因的表达变化,结果表明新基因表达量提高了11倍以上,证实新基因属内皮细胞的极早期应答基因（Immediate early response gene,ERG)。     

Construction of human and mouse brain cDNA libraries and isolation of full-length cDNAs

cDNA libraries from aborted human 3-month fetal brain,adult rat and mouse brain were constructed by using a yZAP express cDNA library construction kin.Low molecular weight fragments of the second strand cDNASA were removed by flowing through the Sepharose CL-4B column and the frractionated long,Middle,Short fragments and the combined fragments weire respectively inserted into clone vectors to construct the cDNA libraries of the brain of human 3-month fetus.The 5'ends of 1200 clones from each of human fetal brain cDNA libraries were sequenced.A total of 894 ESTs were obtained and some full-length clones were squenced.By andalyaing the se-quences,12 novel full-length cDNAs were obtained.     

一条新的人类组氨酰tRNA合成酶类似物全长cDNA的克隆及表达谱分析

从人胎脑文库中克隆到一条长为 12 19bp的cDNA ,它编码 2 3.4ku的肽链 .该肽链与葡萄球菌组氨酰tRNA合成酶N端同源 5 8% .利用humangenomicblast可将其定位于 2 0p11.Northern杂交显示胎脑中有一约1.5kb的单一条带 .基因芯片杂交分析表明 ,其在肺癌和前列腺癌组织中表达较高 .绿荧光蛋白亚细胞定位技术显示该蛋白存在于COS7细胞的细胞质中