水稻C2H2型锌指蛋白OsZAT12转化拟南芥功能的初步研究

摘要:植物C2H2型锌指蛋白是植物转录调节因子中的大家族,通过转录调控、翻译后调节和蛋白质间的相互作用在植物发育和环境胁迫中发挥关键作用. 本研究在水稻基因组中克隆到一个C2H2型锌指蛋白,命名为OsZAT12. 生物信息学分析显示OsZAT12全长597bp,其中不包含内含子,其蛋白质序列含有199个氨基酸,具有两个典型的C2H2锌指结构. OsZAT12蛋白定位于细胞核,在根中特异性表达.过表达拟南芥植株与野生型比较,其根变短,子叶的变绿率明显降低,植株矮小.初步推断OsZAT12可能影响植物生长发育尤其是根的伸长.     

水稻OsDHHC13基因参与氧化胁迫响应的初步研究

DHHC型锌指蛋白参与细胞内蛋白质的棕榈酰化修饰,对细胞和个体的生长发育起着重要的调控作用.OsDHHC13是典型的DHHC型锌指蛋白基因.生物信息学分析发现,OsDHHC13的启动子区域含有胁迫及光响应元件,而且其编码蛋白是具有4个跨膜结构域的典型膜蛋白.对OsDHHC13过表达株系进行H2O2的氧化胁迫处理发现,过表达株系幼苗的根显著长于野生型,说明OsDHHC13能解除H2O2对根生长的抑制,提高了抗氧化胁迫的能力.随后H2O2含量测定发现,OsDHHC13过表达株系幼苗根部的H2O2含量显著低于野生型.进一步的qRT-PCR分析发现,与清除H2O2相关的酶基因的转录水平在过表达株系中显著升高,说明OsDHHC13能促进清除H2O2的相关酶基因的表达,调节内源性H2O2的动态平衡.总之,本研究结果初步证明锌指蛋白基因OsDHHC13正调控水稻的抗氧化胁迫能力.     

大鼠小脑特异基因Zic的克隆、序列分析和初步表达

EST（AW055732）片段是SD大鼠脑内一特异表达基因cDNA的3‘-端片段,与小鼠和人的Zic基因同源。基于小鼠及人的Zic基因的同源序列,设计引物用PCR方法从SD大鼠中克隆得到该基因的编码区序列（rZic)。该基因编码一锌指蛋白,其锌指结构域与线虫的tra-1基因,果蝇的ci^D基因。人的Gli癌基因和果蝇的opa基因的锌指结构域高度同源,用RT－PCR方法分析了rZic基因在大鼠脑区分布状况。结果表明,rZic基因在小脑中高表达。将该rZic基因克隆至带有6个组氨酸的表达载体pET-32a( )中,用IPTG诱导rZic融合蛋白在大肠杆菌BL21菌株中表达,诱导后重组蛋白质占菌体总蛋白的20．8％。     

棉花类耐盐锌指蛋白基因的克隆与结构分析

从棉花花瓣cDNA文库中随机挑选部分克隆，经测序发现一个与拟南芥耐盐锌指蛋白基因同源的cDNA(CSTZ),CSTZ序列全长1012bp，开放阅读框共编码272个氨基酸，含典型的植物双锌指（Cys2/His2)结构区，Northern杂交证实，CSTZ的表达随棉花幼苗钠盐处理浓度的升高而增强，在棉花花龄期，CSTZ基因在叶片，根，花瓣和花药组织中大量表达，在柱头组织中表达相对较弱。     

人类RING型锌指蛋白DTX2的全长cDNA克隆与序列分析

鉴定了一个人类WWE与RING型锌指基因DTX2,位于人染色体7q11.23. 通过RACE获得的全长cDNA显示，DTX2编码包含两个WWE区域与一个RING锌指区域的蛋白.     

一个麻疯树C2H2型锌指蛋白基因JcZFP1的克隆与表达分析

从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个C2H2型锌指蛋白基因,JcZFP1,全长931bp,开放阅读框全长735bp,编码244个氨基酸残基,等电点pI=7.0,分子量PA=27.38kD.C2H2型锌指结构位于第81至103个氨基酸残基中,包括植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH.在该基因的顺式作用元件上发现了与生长发育和逆境胁迫相关的启动元件.荧光定量PCR(qPCR)检测发现,JcZFP1基因在麻疯树各器官中的表达量依次为:绿果皮花叶根茎种仁,且幼嫩器官表达量高于成熟器官;对麻疯树幼苗进行低温、干旱胁迫时,JcZFP1基因的表达量明显增加,表明该基因可能在麻疯树的生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用.     

锌指结构基因HKR1在脑胶质瘤中的表达分析

从人胎脑cDNA文库中筛选到2612nt的锌指蛋白HKR1克隆,C端含有10个C2H2锌指结构,N端含有2个KRAB区域,基因芯片的原位杂交检测显示,HKR1基因表达在脑胶质瘤中明显升高,提示该基因可能是一条潜在的肿瘤相关基因。     

锌指蛋白ZNF191(243-368)G321A;N324L;G321A/N324L突变体的制备和表征

通过分子生物学的蛋白质工程方法对锌指蛋白ZNF191(243—368)的第三锌指区(Gly321和Asn324进行了定点突变，在大肠杆菌BL21中表达，通过DEAE52，CM23，肝素柱CL-6B纯化，最终获得了ZNF191(243—368)(G321A；N324L；G321A／N324L等3个突变体蛋白，运用凝胶电泳、UV光谱、EDTA滴定、金属离子(Co^2’，Ni^2 )取代等方法对突变体蛋白进行了初步表征，这为今后进一步研究该蛋白的结构和功能提供了必要的物质基础。     

人源锌指蛋白ZNF24及其锌指结构域的表达、纯化及DNA结合性质的研究

转录因子是调控基因表达的关键蛋白，能够以序列特异性方式结合DNA。ZNF24是Krüppel-like锌指转录因子家族成员之一，在细胞增殖和分化中起重要作用，能促进肝癌细胞的增殖，抑制神经元细胞的分化。ZNF24蛋白N端包含一个SCAN结构域，C端为锌指区，由4个串联的C2H2型锌指结构组成。ZNF24能特异性识别和结合基因的启动子，参与基因的表达调控，但其发挥功能的具体分子机制并不清楚。本文我们在大肠杆菌中成功表达了人源锌指蛋白ZNF24全长和其锌指结构域ZNF24(243～368),ZNF24全长蛋白在溶液中以三聚体形式存在，而锌指结构域在溶液中为单体，表明ZNF24蛋白N端的SCAN结构域能够促进全长蛋白的寡聚化。凝胶迁移实验验证ZNF24全长蛋白和锌指结构域与双链DNA底物结合能力，为进一步研究锌指蛋白ZNF24调控基因表达提供理论基础，相关结果表明SCAN结构域介导的蛋白寡聚可能代表了一种新的转录活性调节机制。     

拟南芥AtJ2基因植物超量表达载体的构建

在胁迫条件下,分子伴侣可以稳定蛋白质结构,防止蛋白质凝聚变性,并修复受伤害蛋白.J蛋白是一类重要的分子伴侣.AtJ2是拟南芥(Arabidopsis thaliana)J蛋白中的一种.为研究该基因的功能,提取了拟南芥幼苗的总RNA,经过RT-PCR获得了AtJ2的全长.并将其构建入表达载体pMD中,得到重组质粒pMD/AtJ2.通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将此重组质粒转化入拟南芥,得到了转基因植株,为后续该基因的功能研究奠定基础.     

人类磷酸泛酰巯基乙胺结合蛋白新基因的分离和鉴定

在对AD293和HEK293进行差减杂交以探索两者在吸附和凋亡特性上的差异时,从AD293的高表达文库中分离得到一段新的cDNA片段.从人类胎脑文库克隆得到该基因,全长2 745 bp,编码的蛋白含518个氨基酸,被预测为磷酸泛酰巯基乙胺结合蛋白.该基因在染色体上定位于2p22.3,包含8个外显子.该cDNA编码的蛋白序列含有一个凋亡抑制蛋白5结构域,外皮蛋白重复片段和铜结合辛肽重复片段.RT-PCR分析显示该基因在人类正常组织和癌组织中广泛表达,但在癌组织中表达量相对较低,提示其可能对细胞凋亡有抑制作用.该基因在进化过程中高度保守.     

Ran结合蛋白RanBP1的同源基因M3的克隆与功能分析

以Ｒａｎ结合蛋白ＲａｎＢＰ１的保守区域作为探针,低严谨条件下杂交筛人视网膜ｃＤＮＡ文库,得到阳性克隆Ｍ３,它与鼠ｚｈｘ－１基因高度同源。ＲＨ作图将其定位于８ｑ２４．１￣ｑ２４．３。拼接ＥＳＴ序列并填补缺口,得到Ｍ３ ｃＤＮＡ全长４９３４ｂｐ,与Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ得到的主要转录本长度一致。此ｃＤＮＡ全序列包括２６２２ｂｐ开放阅读框,编码８７３氨基酸,含有２种翻译调控元件ｕＵＡＧ和ＴＴＡＴＴＴ     

Rab结合蛋白RanBP1的同源基因M3的克隆与功能分析

以Ran结合蛋白RanBP1的保守区域作为探针,低严谨条件下杂交筛选人视网膜cDNA文库,得到阳性克隆M3,它与鼠zhx-1基因高度同源.RH作图将其定位于8q24.11～q24.3.拼接EST序列并填补缺口,得到M3 cDNA全长4 934 bp,与Northern blot得到的主要转录本长度一致.此cDNA全序列包括2 622 bp开放阅读框,编码873氨基酸,含有2种翻译调控元件uUAG和TTATTTAT.该基因预测蛋白含有2个锌指结构,5个同源盒保守区,1个双侧核定位序列(NLS)及35个磷酸化位点,表明它既可能作为转录调控因子,也可能受到上游因子的调控.     

青岛文昌鱼核糖体蛋白AmphiL 37a基因的克隆和同源性分析

对青岛文昌鱼神经胚cDNA进行测序,获得了3个AmphiL 37a的EST,经拼接得到编码文昌鱼核糖体蛋白的AmphiL37a基因全长cDNA序列并演绎出AmphiL37a的氨基酸序列.通过对AmphiL37a蛋白的结构分析及其与多种脊椎动物和无脊椎动物中同种蛋白的同源性进行比较,发现AmphiL37a具有典型的四个半胱氨酸的锌指结构,与人、鼠、鸡的L37a,尤其与果蝇、隐板石鳖等高等无脊椎动物核糖体L37a具有较高的同源性,说明文昌鱼在进化上更接近于高等无脊椎动物;同时说明核糖体蛋白L37a基因在进化上具有较高保守性.     

一条在人睾丸中高表达的新的环指蛋白(RNF20)

从人胎脑构建的cDNA文库中,通过大规模测序筛选的方法获得一条新基因,该基因蛋白序列含有1个环指（RING finger)基序及2个进核信号（nuclear localization signal NLS)序列,钭此基因命名为RNF20（RING Finger 20),用放射杂交细胞系（Radial hybrid RH)方法定位此基因在人染色体的9q22上,Northern杂交表明,其mRNA在睾丸组织中高表达,用小鼠睾丸做原位杂交表明,小鼠的同源基因在精原细胞及初级精母细胞中高表达,未成年小鼠睾丸中的精原细胞没有发达,提示RNF20可能参与精子发生的调控作用。