纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

一种新型纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从市售纳豆中分离得到一株芽孢杆菌,命名为纳豆芽孢杆菌FDM415.提取其基因组DNA,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得含纳豆激酶编码基因的DNA片段(1179 bp);测序结果证实所分离得到的纳豆激酶编码基因NKM与文献报道(GI:29164926)的NK基因有17个碱基差异,所编码的氨基酸有3个残基不同.将该基因连接到pMG36e表达载体并导入大肠杆菌JF1125中表达,测得的纤溶酶活力为468 U/L.     

辐照灭菌用于纳豆激酶制剂的实验研究

对60钴γ-射线辐照前后的纳豆激酶(NK)制剂有效成分、酶活及活菌数等技术指标进行了实验研究,结果表明,不同剂量的60钴γ-射线辐照对纳豆激酶制剂中的总皂甙含量和纳豆激酶酶活影响不大,30 kGy时总皂甙含量仍可达到原始含量的105%～125%,NK酶活达到原始酶活的90%以上;纳豆芽孢杆菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌等活菌数对60钴γ-射线辐照十分敏感,5 kGy的60钴γ-射线辐照处理后纳豆芽孢杆菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌数量下降99%以上.     

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

纳豆激酶基因导入番茄的研究

将来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase,NK)基因转化到人类可以直接食用的,又非常喜爱的蔬菜—番茄中,得到在转录水平表达的转基因植株.通过根癌农杆菌EHA105介导,转化番茄的下胚轴,诱导愈伤组织形成及分化成幼苗,进而再生出完整植株.提取再生植株基因组DNA,通过PCR扩增检测,结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到番茄植物基因组中.RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达.     

纳豆激酶的高效表达研究进展

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)已成为影响人类健康的主要疾病.纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分泌表达的碱性丝氨酸蛋白酶,具有较强的溶栓活性.文章主要就NK溶栓机理、高效表达方面进行论述,简要概述近年来NK高效表达研究进展,并对未来NK发展趋势进行展望.     

纳豆激酶纯化及性质研究

以蒸煮后的大豆为原料通过纳豆菌发酵,生产纳豆激酶.改进纯化工艺以酸法提取和凝胶过滤纯化出比活性为160.8IU/mg的酶制品.该酶制品不仅对纤维蛋白有很好的溶纤作用,而且对大鼠血纤维（拟血栓）也有很好的溶纤活性,实验还证明该酶制品对大鼠新鲜血液有很好的抗凝性能,尤其是该酶制品在pH值为2.45和经胃蛋白酶作用后仍保持较高的活力.同时,该方法制备工艺简便,有0.6%的高回收率,故本方法提取的纳豆激酶制品有望开发成为新型口服溶栓、防栓制剂,以供医疗和保健应用.     

豆豉生产中高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 共发酵条件研究

通过实验室人工模拟条件，把豆豉感官、生长和纳豆激酶活性作为评判标准，首先采用单因素实验探索了豆豉生产中高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 共发酵的接种量、菌种比例、接种时间和发酵温度 4 个单因素的最佳条件，然后通过正交实验探索了这 4 个因素的联合最佳条件。结果表明，高大毛霉和纳豆芽孢杆菌共发酵的最佳接种量为 4%，菌种比例为10:1，培养温度为25 ℃，发酵时间为56 h；在此条件下毛霉生长繁茂，豉香浓郁，且纳豆激酶活力达1 092.71IU mL-1。高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 混合发酵在保持豆豉原有风味的同时丰富了发酵产生的蛋白酶系，使之具有纳豆激酶活性，为新型保健食品的开发提供了新思路。
     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coli BL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E．coli BL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS—PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33．4kD,约占菌体总蛋白29．4％．     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

纳豆芽孢杆菌的相关研究进展

纳豆芽孢杆菌是一种好氧型革兰氏阳性益生菌,具有较强的热、酸碱稳定性,进入肠道后迅速发育成营养性细胞,抑制肠杆菌、肠球菌、致病菌等的生殖,促进双歧杆菌、乳酸杆菌和梭菌等厌氧菌的生长,调节微生态平衡,代谢分泌出多种促进营养物质消化吸收的酶类,强化消化机能,同时刺激机体内的免疫系统产生干扰素等抗菌物质和高强溶栓功效的纳豆激酶,增强动物细胞免疫功能.纳豆芽孢杆菌可作为天燃防腐剂、微生态制剂、饲料添加剂、酶活性增强剂、免疫增强剂,提高食品的保藏期、动物的日增重和产奶率,运用到水体中可起到净化水质、改良底质等的作用.本文对纳豆芽孢杆菌的菌落结构、生长曲线、发酵产物及其功能应用进行综述,为充分发挥纳豆芽孢杆菌的功能,生产新型绿色国民生活所需品,降低生产成本提供理论支撑.     

纳豆激酶高产菌株产酶特点及其干燥工艺的研究

在分析菌株产酶特点的基础上,对纳豆激酶(NK)制剂的干燥技术及其保存效果进行了实验研究.结果表明,不同NK菌株的产酶特征有明显差别;冷冻干燥和静态微波真空干燥都可用于纳豆激酶的干燥处理,其中冷冻干燥适用于纳豆激酶实验室干燥,而静态微波真空干燥适用于纳豆激酶制剂的规模化干燥;同时静态微波真空干燥时温度以不超过50℃为宜,温度过高则NK活性急剧下降,而且物料颜色变黑;NK经过干燥处理后室温贮藏24个月时,NK活性仍可达到其原始酶活的80%以上,研究结果为纳豆激酶制剂的产业化开发和应用提供了实验数据.     

纳豆激酶液体发酵条件的优化和调控

1987年日本学者须见洋行首先在日本传统食品纳豆中发现一种具有高效溶栓活性的酶,并将其命名为纳豆激酶（简称NK）。纳豆激酶可以降低血液中的脂肪和胆固醇,可以溶解血栓、净化血液。更重要的是,纳豆激酶等活性能物质可以渗透到毛细血管发挥作用,调节微循环,因而有祛斑美容、治疗顽固性过敏引起的皮肤病的效果。目前已经掀起了开发以纳豆激酶为主要原料的保健品热潮。本文通过对纳豆激酶液态发酵条件进行优化,改善发酵条件,在提高NK产量的同时,降低了生产成本,为工业化生产奠定了基础。     

白蚁肠道木质素分解菌PY12的分离鉴定及lip基因的克隆

利用苯胺蓝平板法从白蚁肠道中分离到一株木质素分解高效菌株PY 12,经形态观察、生化鉴定和16 SrRNA鉴定为肠杆菌属的霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei).根据已报道的lip(木质素过氧化物酶,Lignin Peroxidase)基因序列设计特异性引物,克隆该菌的lip基因,将其克隆入pMD19-T载体,获得的核苷酸序列为918 bp,并与GenBank中已知的lip序列进行同源性对比,同源性不高,但该核苷酸翻译后的氨基酸序列比对结果发现,其与假单胞杆菌Pseudomonas sp.编码蛋白质的氨基酸序列同源性为88.5%.     

液体发酵高产纳豆激酶菌株的复合诱变选育

从市售豆豉和保藏的固体发酵产纳豆激酶(NK)高活性的菌株中,筛选出5株诱变育种出发菌株.经紫外-亚硝基胍-Co60复合诱变后,获得5株液体发酵产NK高活性的菌株LJJ-1-13-12-4、PXDBJ-13-9-7-18、DNS-17-3-15-7、CBL-2-7-10-6和L-5-8-15,其产NK活性,分别为1 846.15、1 956.48、2 184.32、1 865.38和2 095.23 U/mL,分别是诱变前出发菌株的1.62、1.81、1.98、1.61和1.62倍.高产纳豆激酶菌株的选育为纳豆激酶液体发酵的进一步工业化奠定了良好的基础.     

纳豆激酶酶学性质研究

通过测定纳豆激酶对4种人工合成底物的水解活性,以及SDS-PAGE电泳分析等,比较了两株高产纳豆激酶菌株发酵产生的纳豆激酶的酶学性质.结果发现两菌株产生的纳豆激酶的最适底物均为N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA;两菌株产生的纳豆激酶对牛纤维蛋白原的水解过程基本一致,反应不同时间,对牛纤维蛋白原不同分子质量的亚基的水解速度不同,9 h后,牛纤维蛋白原基本被全部水解.这为纳豆激酶的进一步研究奠定了基础.     

高效溶栓菌株的筛选鉴定及发酵条件优化

采用酪蛋白平板法,从纳豆激酶胶囊、纳豆及多种发酵食品中筛选出了146株产溶栓酶菌株;然后利用纤维蛋白平板法比较发酵后溶栓酶活力,并从初筛菌株中筛选出1株溶栓酶活达1 637.6IU/mL的高产菌株HT8;依据菌种形态和生理生化特征以及16SrRNA基因序列分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在此基础上,对此高效溶栓菌株的液体培养条件进行了单因素初步实验,方差分析后设计正交试验L18(37),通过软件SPSS分析确定该菌最佳发酵条件为初始pH值8.0、温度40℃、培养体积90mL(容量为500mL的三角瓶装90mL的培养液)、0.5%牛肉膏和2%大豆蛋白胨;优化后的相对酶活力达1 804.08IU/mL。研究结果为进一步开发纳豆等保健食品提供理论基础。