低盐刺激下副溶血弧菌基因转录表达分析

目的:应用全基因组DNA芯片技术分析低盐冷刺激作用下副溶血弧菌基因的转录表达变化.方法:分别采用"低盐持续刺激培养(continuous growth,CTG)"和"中间转入低盐环境培养(shift growth,STG)".CTG和STG下.分别采用含NaCl浓度为2%和0.66%的MV-5培养基孵育副溶血弧菌,收集菌体,提取RNA,应用全基因组DNA芯片分别比较两个不同的转录表达谱基因变化特点,分析其作用规律.同时,应用实时定量逆转录多聚酶联反应对芯片结果进行验证.结果:和对照组相比,STG实验中,共有205个基因的转录表达发生显著性变化,上调的基因占优势地位;CTG实验中,总计有298个基因的转录表达发生显著性变化,上、下涮的基因总体基本趋于平衡状态,没有明显差异.实时定量逆转录多聚酶联反应结果证实其和芯片数据结果有很强的相关性.结论:在低盐这一"胁迫环境"下,副溶血弧菌利用其存在的独特而精细的应对机制,能够顽强的生存下来并繁衍生殖,这一过程中,节能调节处于调控的核心地位.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

舍曲林对副溶血弧菌的抑制作用

近年来关于副溶血弧菌环境和海产品分离株出现抗生素耐药性的报道日益增多,亟需寻找替代传统抗菌剂抗菌的策略以控制副溶血弧菌的污染和感染。本研究通过最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定、生长曲线的绘制,以及运动性实验和结晶紫染色实验,并利用透射电镜观察副溶血弧菌形态的变化,来评估以舍曲林为代表的5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）类药物对副溶血弧菌的抑制活性及抗生物被膜形成能力。同时,通过检测与分析舍曲林对副溶血弧菌毒力基因转录的影响,探究舍曲林对副溶血弧菌的减毒作用。结果显示,舍曲林对副溶血弧菌的MIC为32μg/mL,MBC为64μg/mL,能够损伤其细胞膜和细胞壁,MIC下导致其干瘪皱缩,MBC下引起其涨裂、胞内物质外泄;亚抑制浓度的舍曲林能显著抑制副溶血弧菌的泳动和群集运动,抑制率分别为88.6%和71.5%;舍曲林呈浓度依赖性地抑制副溶血弧菌的生物被膜形成,当舍曲林质量浓度分别为8、16、32和64μg/mL时,对副溶血弧菌生物被膜形成的抑制率分别为66.9%、79.5%、88.3%和89.3%;亚抑制浓度的舍曲林能显著抑制副溶血弧菌的毒力基因fliA、ompW和a...     

含副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因真核表达重组质粒的构建

用ClaI／EcoRI双切酶切带有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)极鞭毛蛋白FlaI基因的质粒p MD18-FlaI，回收目的基因片段，插和到真核细胞表达载体pIRESneo同样经ClaI/EcoRI切开的窗口中，成功地将FlaI克隆到pIRESneo中，获得有意义的重组质粒pIREneo－FlaI,构建的pIREneo－FlaI真核表达重组质粒，将为海水经济鱼类的副溶血弧菌DNA疫苗的研制奠定基础。     

秦皇岛沿海主要海产品副溶血性弧菌及其毒力基因的检测

为了解秦皇岛主要海产品副溶血弧菌污染状况及其毒力特征,依据国家标准GB 4789.7—2013检测方法,并适当改进,分别在春、夏、秋、冬季节,对秦皇岛沿海主要鱼类、虾类、蟹类、贝类进行了副溶血性弧菌的检验。采用PCR方法对分离的副溶血性弧菌进行了tdh,trh,tlh毒力基因检测。结果显示,秦皇岛沿海主要海产品副溶血性弧菌污染相对较轻,其总检出率为10.07%。污染主要发生在夏秋两季,污染品种夏季主要为鱼类和少量贝类,秋季主要为虾蟹类和贝类。4个采样点中,副溶血性弧菌的检出率由高到低依次为:秦皇岛的海港区,昌黎县,北戴河区,山海关区。检出的15株副溶血弧菌均携带tdh和tlh毒力基因,说明秦皇岛沿海主要海产品携带的副溶血性弧菌毒性较强,具有潜在的感染风险。     

重庆市水产品中副溶血性弧菌分离株的毒力基因研究

目的:了解重庆市副溶血性弧菌分离株的毒力基因、血清型以及耐药性,为防治副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供依据.方法:采用PCR方法检测溶血素基因,并结合药敏试验以及血清分型进行综合分析.结果:323份水产品样品中共分离出的35株副溶血性弧菌,其tdh和trh基因携带率分别为14.29%、2.86%,血清群主要为:O3群、O5群、O1群;14株临床分离株主要为O1群、O3群.两组不同来源的菌株均对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星敏感,对氨苄西林均有较强的耐药性.结论:重庆地区水产品中副溶血性弧菌的毒力基因携带率较低,但是血清型呈现多样性,且耐药性较严重,因此存在发生副溶血性弧菌食物中毒的潜在危险.     

白屈菜对低温胁迫应答的生理学研究及分子机制解析

基于生理学和分子生物学方法,对白屈菜低温应答过程中主要生理指标游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等的变化趋势进行了测定、分析,对3个重要温度点样本进行了转录组测序及数据解析.结果表明:在低温胁迫早期,白屈菜通过增加渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量获得抗寒性,此时膜系统相对稳定;当冻害发生时,膜系统受到损伤,相对电导率和丙二醛浓度升高,可溶性蛋白含量显著增加,表明抗冻蛋白被诱导表达,以增强其抗冻性.转录组数据基因(GO,gene ontology)注释分析表明,大量基因被注释到"细胞过程""代谢过程""生物过程的调控"等生物过程,"细胞质组分""细胞膜组分""细胞器组分"等细胞组分及"催化活性""分子结合功能""转运活性"等分子功能中.差异表达基因GO富集分析结果显示,"质膜""质膜锚定组分""叶绿体""叶绿体基质"等细胞组分相关基因变化显著.转录组数据分析揭示了白屈菜低温应答生理变化的分子机制.     

冻害胁迫下马铃薯叶片中酚酸类物质研究

马铃薯野生种Solanum commersonii(CM)具有很强的抗冻性，对低温处理下不同时间点的抗寒材料CM及冷冻敏感材料StGp Phureja(DM)取样，进行转录组及代谢组测序，对116种酚酸类物质进行差异分析.结果表明，11种酚酸物质与抗寒材料CM的耐寒性相关，转录组关联分析筛选出36个转录因子与11种核心差异酚酸物质有相似的表达模式，响应马铃薯低温下的表达调控.     

斜带石斑鱼干扰素调节因子8基因的鉴定与表达模式分析

干扰素调节因子8(IRF8)是IRF家族转录因子中的一个成员.利用简并PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF8基因(EcIRF8)全长cDNA序列,其编码422个氨基酸残基的蛋白质,含有脊椎动物IRF家族的特征性结构域,即N端保守的DNA结合结构域(DBD)和C端多样化的干扰素调控因子结合结构域(IAD),其中DBD中包含5个特征性的色氨酸残基和1个核定位信号.与绝大多数脊椎动物的IRF8基因相似,EcIRF8基因组序列也是9个外显子和8个内含子的结构.EcIRF8在斜带石斑鱼肝脏中高水平表达.活体聚肌胞苷酸刺激后6h,EcIRF8在头肾、中肾、胸腺、肝脏和肠中的表达量显著上调(p0.05),其中在中肾中上调幅度最大,是对照组的106倍;副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)刺激后24h,EcIRF8在肝脏中的表达量也显著上调(p0.05),但上调倍数仅为对照组的9.37倍.结果表明,EcIRF8基因可能主要参与斜带石斑鱼的抗病毒免疫反应.     

冷驯化下的牛皮杜鹃转录组变化分析

冷胁迫是限制植物生长和分布,降低作物产量的重要环境因子.冷驯化是温带植物对抗冷胁迫的有效手段.本研究以具有耐寒能力的高山植物牛皮杜鹃(Rhododendron chrysanthum Pall.)作为研究对象,探究冷驯化前后牛皮杜鹃的基因表达和代谢通路的变化.基于转录组数据的测序结果:常温组和驯化组的总reads分别为103 951和113 093.将获得的unigene在KEGG、GO、KOG、Nr、Nt、Swissprot和Pfam数据库中进行比对注释,有78.67%的unigene在Nr数据库中获得了注释,比列最高.比较常温组和冷驯化组的差异表达基因为21 489,其中上调和下调的基因分别为11 213和10 276个.GO功能分类表明差异表达基因主要富集在"DNA为模板的转录调控""信号转导""细胞氧化还原稳态""蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶""RNA结合"和"细胞";KEGG路径分析显示:差异表达基因富集在132条通路上.显著性最高的生物学过程包括:光合作用、ABC载体运输、氨基酸代谢和次生代谢物质合成等.结合差异表达分析,特别地关注了脂肪酸代谢及其信号转导通路的磷脂酶基因,筛选到了10个和脂肪酸去饱和有关的基因以及12个和磷脂酶相关的基因.研究结果对揭示牛皮杜鹃的耐寒分子机制有一定的参考意义.     

温度对刺槐实生苗中过氧化物酶同工酶的影响

<正>酶系统的多型性有很重要的生物学意义。这方面的研究虽还不够充分,但可认为,包括过氧化物酶在内的同工酶参加了个体发育过程和细胞内的调节作用,使植物具有对非生物环境因素的适应能力。温度在对植物起作用的不同生态因素中占有特殊的地位,能决定种的分布界线和不同气候带的植被成分。植物对温度因素的适应机理已研究多年,但至今未建立满意的抗性理论。从另一方面说,植物抗性研究多偏重于低温的作用,往往忽视高温的影响。为此,我们选用对环境适应性较强的刺槐实生苗作为材料,研究高温和低温对过氧化物酶同工酶的诱导作用,为阐明木本植物抗性提供参考。     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

绵羊β—乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究

本对绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法扩增进行了研究。经比较分析,将从羊血中提取的绵羊基因组DNA的模板用量定为4μl(0.4μg/μl）,TaqDNA聚合酶用量为0．83μl(3u/μl）,变性为94℃1min,退火为64℃1min72℃延伸2min,循环次数为32次,获得的PCR产物经电泳检测,条带明亮,特异性高,大小为898bp。经序列分析发现,与已知基因组序列一致性达99％以上,可用于指导外源基因在转基因动物乳腺中表达。     

松香粘度的研究

<正>在125℃到200℃温度范围内,研究了十一种中国脂松香的粘度与温度关系。松香粘度是用高温毛细管粘度计测定的,然后用v=C下公式计算,式中v[厘斯]是脂松香粘度,C是仪器常数,下[秒]是时间。 将粘度数据和软化点以及温度关联获得计算这些数据的方程式。下面的方程式在125℃到200℃温度范围内能很好地符合松香的实验数据式中t_s[℃]是软化点,t[℃]是松香的温度,v[厘斯]是脂松香的粘度。应用此方程式可以根据松香的软化点和温度计算其粘度。     

温度和光照对拟南芥VHA-c基因启动子活性的调节

转VHA-c2-GUS,VHA-c3-GUS和VHA-c5-GUS基因烟草在4℃和40℃温度胁迫以及25℃光/暗处理条件下叶片GUS表达水平表明,VHA-c具有光调控性,并可被逆境温度所调节.VHA-c2,VHA-c3和VHA-c5均可被4℃低温和光照促进表达.40℃高温可显著促进VHA-c3的表达,对VHA-c5有轻微的促进,而对VHA-c2则表现出轻微的抑制作用.     

废干电池回收制取氧化锌超细粉体

采用均匀沉淀法可由废干电池回收制取氢氧化锌超细粉体,通过正交实验优化反应条件,得出在反应温度为60℃,反应时间为60 m in,尿素浓度为5%以及反应液的pH值为6.5的条件下所得氢氧化锌前驱体的平均粒径为4.87μm;前驱体在400℃,焙烧2 h后,可得平均粒径为8.67μm的氧化锌产品.     

水稻土壤宏基因组中的β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及酶活的研究

β-葡萄糖苷酶(Ec3.2.1.21)属于糖苷水解酶家族3,它能够水解非还原性末端的β-D葡萄糖苷键,释放出游离的葡萄糖及相应的配基。β-葡萄糖苷酶是纤维素降解中的关键酶,对于可再生资源纤维素的利用具有十分重要的意义。本研究从水稻土壤中分离得到β-葡萄糖苷酶基因pds5,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,转化BL21大肠杆菌中,并诱导表达该基因。重组BL21大肠杆菌用IPTG诱导后,所提取的酶蛋白具有β-葡萄糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其相对分子质量为83 kD。通过控制pH和温度的方法,测得该酶酶活最适pH为7.0,最适温度为37.5℃。     

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。     

脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达

目的筛选出脂肪酶活性较高菌株,通过脂肪酶基因克隆技术获得高表达的脂肪酶,根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.方法采用透明圈法,以三丁酸甘油酯为底物筛选脂肪酶活性较高菌株;通过PCR扩增获得其脂肪酶基因Pseudomonas peli(PP)序列,构建pET-28 a表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达;通过Ni柱将脂肪酶纯化,并根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.结果筛选到一株脂肪酶活性较高的菌株,16S rRNA基因序列比对结果初步鉴定为Pseudomonas peli.PCR扩增得到的基因片段长度为801 bp,其序列与Pseudomonas peli中的脂肪酶基因序列相似性达到100%,PP基因在大肠杆菌中异源表达蛋白的分子量约29 KD,该蛋白在55℃、pH 7.0时活性最高.结论通过基因克隆表达后得到的脂肪酶Ni柱纯化后纯度达95%以上,且耐高温,为脂肪酶工业化应用奠定了基础.     

不同高温对HepA细胞的杀伤作用

目的 :研究不同温度对肿瘤细胞的杀伤作用。方法 :将肝癌腹水型瘤株HepA细胞分为 37℃、4 0℃、4 5℃和 5 0℃ 4个温度组 ,每组又分为 15min、30min、1h和 2h 4个时间亚组。经相应的温度和时间处理后 ,以MTT比色法检测细胞活性。结果 :不同温度对HepA细胞的杀伤作用有所不同。在一定的温度下 ,伴随作用时间的延长 ,细胞死亡率也随之增加。结论 :随着温度的增高和作用时间的延长 ,其对HepA细胞的杀伤作用逐渐增强。4 0℃作用较长时间后 ,细胞的死亡率明显升高