卵形鲳鲹主要致病链球菌多重PCR诊断技术的建立

【目的】快速、准确地检测卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcus garvieae)4种主要的致病菌,为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据。【方法】针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R,建立多重PCR反应体系,通过调试各引物对之间的最佳比例以及最适退火温度,对反应体系进行优化及灵敏度测试。2014年6~8月,应用该体系对北海及湛江各养殖场的发病卵形鲳鲹进行检测,然后用通用引物扩增16SrRNA基因,经测序、比对检测体系的准确性。【结果】反应体系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2μmol/L,0.08μmol/L,1.6μmol/L和0.4μmol/L;最优退火温度为54.3℃;4种目标菌的检测灵敏度为5×10~(-2) ng/μL;11份病原样品检测中,2份出现海豚链球菌的目的条带,4份出现无乳链球菌的目的条带,5份未见目的条带,和测序分析结果一致。【结论】多重PCR方法能代替传统的微生物检测方法特异、快速、灵敏地检测4种致病菌。     

用PCR扩增裸甲藻和微小原甲藻rRNA基因的方法研究

以赤潮种裸甲藻(Gymnodinium sp．)和微小原甲藻(Prorocentrum minimum)为试验材料，以不同方法提取其基因组并进行纯化，然后采用PCR方法扩增其rRNA基因，包括18S，28S和ITS片断，并进行扩增条件的比较和优化，得到两种藻的最佳DNA提取条件和PCR扩增条件．裸甲藻和微小原甲藻的DNA提取宜采用改良的CTAB方法；并需对粗提取的DNA用CTAB方法进行纯化．两种藻的最适模板浓度为纯化后模板1．0～2．0μL；最适Mg^2 浓度为2．0μL(25mmol／L)；ITS引物PCB扩增的退火温度为50℃，而18S三对引物的退火温度均为55℃，28S的退火温度为54℃最为适宜。     

人博卡病毒微滴数字PCR定量方法的建立

为准确、快速地从临床鼻咽拭子样本中筛选出人博卡病毒(HBoV)感染的阳性样本,以HBoV-sh9基因的保守区序列为检测靶标合成引物和探针,建立了微滴数字PCR(dd PCR)检测HBoV的方法.结果表明:HBoV dd PCR方法具有较高的特异性,在(0.5~6.8)×10~3copies/μL HBoV DNA浓度范围内,具有良好的线性和精确度,定量限低至0.5 copies/μL.182份临床样本检测结果显示:HBoV感染的阳性率为8.24%.此建立的HBoV dd PCR方法在定量限、准确性和重复性上较常规PCR优势明显,不受样品基质和扩增效率的影响.     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术，并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物，将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度，利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好，与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系，方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰；该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比，热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV) 3D基因保守区段设计并合成1对引物, 以提取的EMCV核酸为模板, 分别进行荧光定量RT PCR扩增, 优化反应体系及条件, 建立脑心肌炎病毒荧光定量RT PCR检测方法, 并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证. 结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%, 最低检测限为102 copies/ μL; 纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.     

扬子鳄SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

以扬子鳄总DNA为材料,对影响SRAP-PCR的Mg2 、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物浓度等因素进行了优化,分析了TaqDNA聚合酶、样本浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度以及引物浓度对SRAP-PCR扩增结果的影响.筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物l3对,建立了稳定的、可重复的扬子鳄SRAP-PCR最佳反应体系及PCR扩增参数.研究结果表明:在30μlSRAP-PCR反应体系中,样本最适宜为1μl(30ng/μl),Mg2 的最适为2μl(2.5mmol/L),dNTPs最适为2μl(2.5mmol/L),单引物的最适均为1μl(10pmol/μl);聚合酶在30μl反应体系中宜加入1U.SRAP-PCR引物筛选及其反应体系的建立,为今后利用SRAP标记技术开展扬子鳄种群的分子生物学研究提供了一个标准化程序和强有力的工具.     

新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增体系的优化

以3个新疆杏品种的叶片为试材,以其叶片基因组DNA为模板,分别对PCR扩增体系中的10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、TaqDNA聚合酶和退火温度5个因素设计6个梯度,研究了新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增条件,建立其优化的PCR扩增体系。研究结果表明:其扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸2min,35个循环后72℃延伸10min,25μL反应体系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP0.08mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA80ng,DNA聚合酶1μL,此为最优的反应体系。     

真藓(Bryum argenteum)ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定真藓最佳ISSR-PCR反应体系,采用PCR正交实验设计方法,对影响ISSR-PCR试验的模板DNA、引物、d NTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶5个因素在4个水平上进行优化,并对100条引物逐一进行温度梯度PCR,筛选合适的引物并确定每个引物的最佳退火温度.结果显示优化的20μL ISSR-PCR反应体系中包括20 ng/20μL DNA模板、0.45μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg~(2+)、0.4 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/Ld NTPs.利用该体系最终筛选出50条扩增条带清晰,重复性好,多态性高的引物并确定其退火温度.这一体系的建立、引物的筛选及退火温度的确立为进一步利用ISSR分子标记技术对苔藓遗传多样性的研究提供理论基础.     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

华山松ISSR反应体系的优化

为获得条带清晰、稳定和多态性高的华山松ISSR扩增结果,对引物、Mg~(2+)浓度和退火温度等因素进行了优化.确定了ISSR分析的最佳PCR条件:15μL反应体系中,10×PCR buffer反应缓冲液1.5μL,模板DNA 22.5 ng,Mg~(2+)2.2 mmol/L,d NTPs 0.23 mmol/L,引物0.93μmol/L,Taq DNA聚合酶0.027 U/μL.PCR反应程序为:经94℃预变性4min后,经过94℃变性30 s,Tm-4.8℃退火30 s,72℃延伸108 s共33个循环;循环结束后72℃延伸10 min.从44条ISSR引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.对华山松ISSR实验优化体系的建立,为今后利用ISSR分子标记技术开展华山松种间遗传变异分析和构建遗传图谱等研究奠定了基础.     

小鼠腺病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的基于TaqMan建立小鼠腺病毒(MAdV)特异的荧光定量PCR检测方法,用于调查长爪沙鼠和小鼠等实验动物中MAdV感染情况。方法从NCBI下载小鼠腺病毒(MAdV-A和MAdV-3)基因组序列,比对分析后选择保守性较好的基因设计引物和探针。筛选最佳引物对和探针,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证,运用所建立的方法对长爪沙鼠和野鼠的共41份样本进行检测。结果经特异性和灵敏度鉴定,在设计的3对引物探针中确定一对最佳引物探针MAD-3,可区分小鼠腺病毒与猴腺病毒、禽腺病毒和树鼩腺病毒等24种病原,MAdV质粒DNA最低检测限为4.5 copies/reaction;MAdV纯病毒液和病毒/组织模拟样本的最低检测限均为440 copies/reaction。结论建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法特异、灵敏和稳定,可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物及鼠源性生物制品MAdV的检测。     

RT—PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）为草鱼出血病的病原．本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法．该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120nmol／L,最适退火温度为52℃．PCR特异性试验表明：所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA．敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性．用所建立的RT—PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT—PCR检测方法可靠且可行．     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为:25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2+2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

肝片形吸虫种类鉴定PCR方法的建立

为了建立一种快速鉴定肝片吸虫种类的特异PCR方法,以肝片形吸虫基因组DNA为模板,以前后盘吸虫,胰阔盘吸虫,日本分体吸虫,牛弓首蛔虫、大片吸虫gDNA为对照,用肝片形吸虫特异性引物ITS-1、ITS-2进行PCR扩增,PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪观察;用核酸蛋白测定仪测定肝片形吸虫gDNA的浓度,然后将gDNA原液进行不同倍数的稀释,筛选最佳条件,进行敏感性检测.结果显示只有肝片吸虫样品有特异性条带,对照样品均呈阴性;可以检测到的最低DNA浓度分别为1.17 ng/μL、0.59 ng/μL.     

绵羊β—乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究

本对绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法扩增进行了研究。经比较分析,将从羊血中提取的绵羊基因组DNA的模板用量定为4μl(0.4μg/μl）,TaqDNA聚合酶用量为0．83μl(3u/μl）,变性为94℃1min,退火为64℃1min72℃延伸2min,循环次数为32次,获得的PCR产物经电泳检测,条带明亮,特异性高,大小为898bp。经序列分析发现,与已知基因组序列一致性达99％以上,可用于指导外源基因在转基因动物乳腺中表达。     

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

目的 建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法,并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法 针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果 成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为1.0×101 copies/μL～1.0×109 copies/μL,相关系数为0.998,检测极限达10 copies/μL;特异性结果显示所建方法具有良好的特异性,并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论 实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。     

兔泰泽病原体实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立一种适用于兔泰泽病原体检测的实时荧光PCR检测方法。方法 根据泰泽病原体的16S rRNA序列设计了特异性的引物和探针,对引物和探针浓度进行了优化,并评价其敏感性、特异性和重复性。同时,使用该方法对临床样品进行了检测,并与已报道的套式PCR方法进行比较。结果 建立了能够特异检测泰泽病原体的实时荧光PCR检测方法,该方法检测质粒标准品的最低检测限为8 copies/μL,不与SPF级实验动物必须排除的多种细菌发生交叉反应,批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对70份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法。结论 建立的实时荧光PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,适用于兔粪球样本中泰泽病原体的检测。     

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2 浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.     

沙棘属植物RAPD-PCR反应条件的优化

采用L16(45)正交试验设计研究了沙棘属植物RAPDPCR反应中DNA模板浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2 浓度和Taq酶含量等5个因素对于PCR扩增效果的影响,并对照温度梯度探讨了退火温度等热循环参数,确定适合沙棘属植物的最佳扩增体系为:模板DNA1.0mg·L-1,引物3.0μmol·L-1,dNTPs0.1mmol·L-1,Mg2 2.5mmol·L-1,Taq聚合酶8.33～16.67nkat;扩增程序中最适退火温度为35～36℃.