小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 方法的建立

摘要: 目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox 基因、假结核耶尔森氏菌inv 基因、志贺氏菌ipaH 基因及空肠弯曲菌gyrA 基因设计并筛选出特异性引物; 优化退火温度等条件,分析多重PCＲ 的特异性、敏感性,使用该多重PCＲ 方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCＲ 扩增出了预计的PCＲ产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌( 511 bp) 、假结核耶尔森氏菌( 779 bp) 、志贺氏菌( 290 bp) 和空肠弯曲菌( 156 bp) 。该方法的灵敏度为1 × 10 － 3 ng /μL( 小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌) 和1 × 10 － 2 ng /μL( 空肠弯曲菌) 。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCＲ 方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

江黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生物学特性研究

从发病江黄颡鱼中分离出菌株YER6022,通过细菌培养、生理生化试、16SrDNA基因扩增等方法对其生物学特性进行研究.结果表明:该菌株为革兰氏阴性球杆菌,具有动力性,不发酵山梨醇,赖氨酸、苯丙氨酸阴性,尿素、鸟氨酸阳性.16SrDNA片段测序为1408bp,与小肠结肠炎耶尔森氏菌相似性达99％,GenBank登录号为JX434637.系统进化树显示菌株YER6022与耶尔森菌属的小肠结肠炎耶尔森菌亲缘关系最近.     

乳粉中常见致病菌的多重荧光PCR检测

利用多重荧光PCR技术快速检测乳粉中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌.以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因,选择特异性引物,以参照菌种为对象,验证引物的特异性,建立多重荧光PCR检测方法,人工添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌,确定方法的检出限.结果表明该方法特异性强、灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为1CFU/mL,可在8h内完成对乳品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测.     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

空肠弯曲菌多重毒力基因检测方法的建立

为了快速检测食品中空肠弯曲菌,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)对空肠弯曲菌保守序列(mapA)和细胞毒素调节基因(cdtB)预扩增后得到的双链核酸进行胶体金试纸条免疫检测,随着被检物中空肠弯曲菌浊度的增大,胶体金试纸条上的保守序列及其毒力基因检测线强度也呈梯度式变强。结果表明,空肠弯曲菌中mapA及cdtB的检出限均为10~1 CFU/mL,实际样品的检测结果也呈现出极好的梯度。表明该方法具有灵敏度高、特异性好、简单快速等特点,为食品及环境中空肠弯曲菌的检测提供了一种新方法。     

痢疾志贺氏菌8型O-抗原基因簇的破译和特异基因的筛选

志贺氏菌是引进细菌性痢疾的重要病原菌，尤其对发展中国家卫生条件不平衡的地区，可造成爆发性流行．本研究用鸟枪法对痢疾志贺氏菌8型的O—抗原基因簇进行测序，得到序列全长为9227bp．用生物信息学的方法进行序列分析，共发现7个基因，分别是：单糖合成基因gne，糖基转移酶基因(4个)；O—抗原转运酶基因wzx和O—抗原聚合酶基因wzy．并用PCR的方法筛选出了针对痢疾志贺氏菌8型细菌的特异基因，可以用于基因芯片或PCR方法对痢疾贺氏菌8型细菌的快速检测．     

应用PCR技术检测志贺氏菌

建立一种快速检测志贺氏菌PCR检测方法。根据志贺氏菌的侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,设计引物,建立PCR检测方法。本方法特异性高,均能检测出志贺氏菌属的4个种,整个实验过程8～10h完成。建立的方法可用与实际检测。     

食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌生物学特性和分子分型研究进展

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）是一种重要的嗜冷肠道致病菌,研究表明Y.enterocolitica血清型有60多种,我国致病性菌株生物/血清型以3/O∶3和2/O∶9型为主;另外Y.enterocolitica具有1A、1B、2、3、4、5共6个生物型,除了1A型可能具有潜在致病性外,其他5个已确定具有致病性,且1B为高致病性菌株;主要毒力因子有ail、ystA、ystB、yadA和virF,常用来判断小肠结肠炎耶尔森菌的致病性;Y.enterocolitica对氨苄西林和一代头孢类抗生素天然耐药,对其他抗生素有不同程度耐药性,并且许多菌株具有多重耐药性.常用的分子分型方法有脉冲场凝胶电泳、扩增基因重复序列、多位点序列分型等,其中具有操作简便和多态性高的ERIC-PCR在Y.enterocolitica分型中也将发挥较好作用.     

小肠结肠炎耶氏菌实验性感染家兔的病理学研究

本文报告应用小肠结肠炎耶尔森氏菌以６×１０８的细菌数，经静脉注射家兔的病理学观察实验结果表明，致病性血清型带毒力质粒小肠结肠炎耶尔森菌菌株Ｇ１５１（血清型０：９）和ＬＡＢ－８１８２（血清型０：３）引起家兔组织严重的病理学改变：血细胞渗出，微脓肿和菌落形成，组织变性坏死、溃疡．致病性血清型丢失毒力质粒的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株８２－１４０（血清型０：８）注射的家兔组织病理学改变轻微．４９３－８０Ｖ－（血清０：９）不引起家兔组织病理学改变．     

单因子和正交设计法建立分枝杆菌多重PCR体系

为了建立一种快速区分鉴定结核与非结核分枝杆菌的多重PCR方法,以分支杆菌属特异基因32kD,结核分枝杆菌种特异基因MTP40和结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110为目标基因,设计合成3对特异性引物,以结核分枝杆菌标准株DNA为模板,通过对PCR反应体系中DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度5个因素的正交设计,以及PCR反应条件中各反应参数的优化,建立了鉴别分支杆菌的多重PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了验证。结果显示:该方法对结核分枝杆菌标准株H37Ra能扩增出506、396和984bp,对卡介苗(BCG)能扩增出506和984bp片段,对禽分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌能够扩增出506bp片段,对大肠杆菌等的扩增结果均为阴性。建立的多重PCR敏感度最低可检出6.6×10-6 ng。结论:该方法具有特异性高、敏感性好等特点,可用于奶牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。     

PCR-DHPLC技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法．根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验．试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR—DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌．该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术．     

POR-DHPLO技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法．根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验．试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR—DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌．该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术．     

PCR检测乳粉中肺炎克雷伯氏菌

利用PCR技术直接检测乳粉中的肺炎克雷伯氏菌,无需增菌.通过滤膜法成功地从人工污染肺炎克雷伯氏菌的乳粉中提取了肺炎克雷伯氏菌的DNA.以肺炎克雷伯氏菌的间区序列(ITS)为靶基因,经过PCR扩增得到158 bp的产物,经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物.该方法灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为10CFU/mL,可在6 h内完成对乳品中肺炎克雷伯氏菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12-24 h.     

单增李斯特氏菌快速鉴定技术的研究

目的:建立单增李斯特氏茵快速鉴定技术;方法: 选择Hly、Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增;结果: 单增李斯特氏菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特氏菌均扩增出两奈明显条带,其它食品中常见致病菌及非增李斯特氏菌均不见扩增条带.52株李斯特氏茵生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%(P＞0.5;X2=0.5).结论: 本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感性强、特异性高的单增李斯特氏茵鉴定方法.     

禽肉中弯曲菌的分离、PFGE和DGGE分型

随机选取某肉菜市场8份鸡肉和鸭肉样品中的弯曲菌(Campylobacter),分别采用Bolton和Preston肉汤增菌,然后以Skirrow、mCCDA选择分离培养和膜过滤的方法同时分离,运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)对分离出的菌株进行分子水平的分型和溯源.结果表明:共有6份样品污染了空肠弯曲菌(C.jejuni)或结肠弯曲菌(C.coli);Preston肉汤增菌、mCCDA选择分离培养法的分离效果最好;4份样品被同一种C.coli污染,2份样品分别污染了2种C.jejuni和3种C.coli;与PFGE相比,DGGE分型方法的灵敏度略低,但更快速、成本更低,且稳定、准确,可用于食品中弯曲菌的快速分型.     

牙鲆迟钝爱德华氏菌的分离及其鉴定

从患腹水病牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化鉴定方法对该菌进行了鉴定;根据GenBank上报道的迟钝爱德华氏菌标准株(ATCC15947)的16S rDNA序列以及致病性迟钝爱德华氏菌所含有的菌毛亚基(Fi mA)基因(AB100170)的核苷酸序列设计了2对引物,对所分离到的6株疑似菌进行PCR扩增,均能够扩增出目的条带,基因片段大小分别为1 399,540 bp.序列分析表明,扩增得到的基因与其参考菌株序列高度同源,同源性分别为98.86%,100%.分子生物学鉴定结果与常规细菌鉴定方法所得结果一致,证明该菌为迟钝爱德华氏菌.将该菌肌肉注射鲫鱼,发病症状与自然死亡的症状相似,并从患病鲫鱼体内分离到该菌,说明所分离的迟钝爱德华氏菌是患病牙鲆的原发病原菌.     

肠结肠炎耶尔森氏菌血清型在我国的分布

小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersina enterocolitica,以下简称Y.e.)在世界范围内已进行了较为广泛的研究.迄今已有70多个国家报告了Y.e.菌的存在,传播Y.e.菌的宿主证明有动物、昆虫等50多种.我国Y.e.菌的研究工作起始于1979年,至今已整十年,先后有山西、河南、江西、福建、广西、吉林等15个省、区报导从人、畜、昆虫等22种宿主(包括9种动物园观赏动物)和人体外环境中检出Y.e.菌,已进行血清学定型的菌株共含有33个“O”抗原因子(见后).我们开展这项研究工作亦较早,对我省检出的Y.e.菌菌株和广西、福建、湖南等地的送检株进行了部分血清学分型工作.现将Y.e.菌各血清型在我国不同地区和不同动物中的分布情况报告如下.     

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。     

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三重PCR检测方法的建立

通过设计三对引物分别扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(RV)的特异性基因,建立了一个能对TGEV、PEDV及RV感染鉴别诊断的三重PCR方法。该方法能同时检测TGEV的M基因252bp片段、PEDV的N基因540bp片段及RV的VP7基因412bp片段,而对CSFV、PCV2、PRRSV、PRV等无扩增,其检测TGEV、PEDV及RV的极限为100pg核酸/μL;用该方法对临床收集的26份粪便样品进行检测,结果表明:建立的多重PCR方法具有特异性强,强灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查。     

应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

应用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)技术建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157三种致病菌的高通量简易检测方法.实验分别以沙门氏菌的inv A基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfb E基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了TemPCR检测方法.结果表明,建立的Tem-PCR方法特异性强,其检测灵敏度分别为沙门氏菌1.1×103CFU/m L、单核细胞增生李斯特氏菌5.6×102CFU/m L、大肠埃希氏菌O157 2.3×103CFU/m L.方法不需要优化调整各引物对的浓度,易于使用,有效地解决了传统多重PCR方法扩增效率不均衡的问题.