环介导等温扩增技术检测乳粉中肺炎克雷伯菌

以荚膜脂多糖(capsular polysaccharide,CPS)合成调控子resA为靶基因片段,设计了肺炎克雷伯菌特异性引物,建立了环介导恒温扩增技术(Loop-Mediated lsothermal Amplification,LAMP)检测方法.结果表明,3对LAMP引物对肺炎克雷伯菌不仅有菌种专一性,而且,具有相当高的灵敏度(2 CFU/100 g).因此,该方法有利于更快更准确的鉴定食品中肺炎克雷伯氏菌.     

乳粉中常见致病菌的多重荧光PCR检测

利用多重荧光PCR技术快速检测乳粉中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌.以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因,选择特异性引物,以参照菌种为对象,验证引物的特异性,建立多重荧光PCR检测方法,人工添加沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌,确定方法的检出限.结果表明该方法特异性强、灵敏度高,乳粉中检测的灵敏度为1CFU/mL,可在8h内完成对乳品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测.     

野葛特异性PCR检测方法的建立与应用研究

一个物种特有的DNA序列可以开发成能够识别该物种及其加工产品的标记.为寻找野葛(Pueraria lobata)特有的DNA序列,建立野葛特异性PCR检测方法,通过对Gen Bank中野葛基因信息的检索分析,筛选出了同源序列少特异性强的野葛查耳酮合成酶基因作为研究对象.对该基因的特定区域设计引物,建立了野葛特异性定性PCR检测方法.利用该方法对野葛14个不同居群的DNA进行PCR扩增,均能扩增出226 bp的片段.而用相同引物分别对20种其他植物的DNA进行扩增均未出现特异性扩增产物. PCR灵敏度实验结果表明该方法的检测灵敏度达到0.02 ng基因组DNA,对市场上的葛根产品进行检测结果表明该方法可以有效鉴定葛根产品中是否含有野葛成分.该野葛特异性PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可用于野葛成分的检测与鉴定.     

利用酵母同源重组系统克隆肺炎克雷伯菌基因组岛

利用酵母同源重组系统克隆耐药性条件致病菌肺炎克雷伯菌的基因组岛.具体方法为:对20株从临床中分离的肺炎克雷伯菌进行体外tRIP PCR扩增以搜索外源基因纽岛;利用酵母同源重组系统构建作用于arg6 tRNA基因位点的酵母捕捉载体YCV6并克隆该位点的基因组岛.结果表明:在该20株肺炎克雷伯菌中,arg6 tRNA基因位点的tRIP PCR结果都是1.2 kb,没有筛选到大基因组岛插入;所构建的酵母捕捉载体YCV6携带了2个1.8 kb的靶序列,分别与肺炎克雷伯菌arg6 tRNA基因位点两侧的保守序列同源;将线性化的载体YCV6与肺炎克雷伯菌临床株HS04044的总DNA一起转入酵母细胞,利用酵母同源重组克隆临床菌株HS04044染色体上插入arg6位点的小基因组岛.该位点特异性的捕捉载体YCV6可用于克隆肺炎克雷伯菌临床株染色体插入arg6位点的外源DNA序列.     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR方法的建立

目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCR检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因、假结核耶尔森氏菌inv基因、志贺氏菌ipa H基因及空肠弯曲菌gyr A基因设计并筛选出特异性引物;优化退火温度等条件,分析多重PCR的特异性、敏感性,使用该多重PCR方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌(511 bp)、假结核耶尔森氏菌(779 bp)、志贺氏菌(290 bp)和空肠弯曲菌(156 bp)。该方法的灵敏度为1×10-3ng/μL(小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌)和1×10-2ng/μL(空肠弯曲菌)。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCR方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

啮齿类实验动物唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光定量PCR方法的建立及应用

目的 建立用于检测实验动物小鼠中唐菖蒲伯克霍尔德菌的荧光定量PCR方法。方法 参考团标公布的序列合成唐菖蒲伯克霍尔德氏菌引物、探针和质粒，建立荧光PCR方法，并对方法的线性、灵敏度、重复性和特异性等性能进行验证。同时应用建立的荧光PCR方法和细菌培养法对110份小鼠送检样品进行比对检测。结果 建立的唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光PCR方法，相关系数R²可达0.998,线性良好；方法最低可检测至1×10² copies/5μL,灵敏度高；方法检测培养的唐菖蒲伯克霍尔德菌为阳性，检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、绿脓杆菌和嗜肺巴斯德杆菌均为阴性，特异性良好。采集110只安乐死小鼠样品，分别进行细菌培养和荧光PCR检测，结果均为阴性，2种方法结果完全符合。结论 建立的荧光PCR方法性能良好，可用于实验动物小鼠唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测。     

一种快速检测蛋鸡沙门氏菌的方法

为检测蛋鸡泄殖腔拭子中沙门氏菌,在基础培养基BPW的基础上,优化出了培养仅需6 h的选择性增菌液SEM;并根据蛋鸡泄殖腔拭子中的非沙门氏菌干扰菌种类,设计了沙门氏菌特异性检测引物hilAP3.结果表明：1)低数量(1~5 CFU/50mL)沙门氏菌在优化后的一步法选择性增菌液SEM中培养6 h 后,其生长量可达103 CFU/mL 以上,可满足 PCR方法的检测限(102 CFU/mL);2)hilAP3引物能排除蛋鸡泄殖腔拭子中的非目标菌的干扰,特异地检测其中的沙门氏菌;3)建立的SEM增菌6 h与hilAP3特异引物PCR联用的方法检测灵敏度为1~5 CFU/50mL,准确率为100%.因此,该研究中建立的优化增菌液与PCR联用法能在9h内完成沙门氏菌的检测,其灵敏度和特异性高,可应用于蛋鸡场的沙门氏菌检测.     

POR-DHPLO技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法．根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验．试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR—DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌．该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术．     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

PCR-DHPLC技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法．根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验．试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR—DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌．该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术．