建立一种快速鉴定大西洋鳕鱼及其制品的SYBR Green荧光PCR方法

通过大西洋鳕鱼CoxI序列的比对分析,在序列的差异处设计了大西洋鳕鱼的特异性引物,建立了一种大西洋鳕鱼SYBR Green荧光PCR定性检测方法,并进行了引物特异性和灵敏度分析.结果表明:检测的大西洋鳕鱼样品和49份其他动、植物样品DNA中,只有大西洋鳕鱼样本出现显著扩增,6次平行反应的Ct值为23.216±0.113,5份大西洋鳕鱼同属鳕鱼样品和44种常见其他动、植样品均无明显扩增曲线.模拟样品灵敏度检测实验显示,该特异性引物可用于检测质量分数为0.01%的大西洋鳕鱼肉粉,灵敏度可达0.06ng/μL.通过对市售鳕鱼片检测的验证,该方法特异性强,灵敏度高,可用于食品中大西洋鳕鱼成分真实性的鉴别.     

实时荧光PCR方法检测含麸质的谷类产品管家基因

采用实时荧光PCR方法鉴别含麸质的谷类成分,选择大麦Hordein管家基因、小麦Gliadin管家基因、黑麦Sec1管家基因和燕麦Avenin管家基因作为物种鉴定的特异性标记基因,设计适合于Taqman探针实时荧光PCR扩增的引物和探针,从而达到鉴别检测食品中含麸质的谷类大麦、小麦、黑麦、燕麦成分的目的.特异性实验结果表明,分别采用大麦、小麦、黑麦、燕麦的引物和探针进行实时PCR扩增时,经检测25种样品,只有相对应的阳性物种样品产生荧光信号,其余非该物种样品均不产生荧光信号,表现出了很高的物种鉴定特异性.以大麦为例的灵敏性实验结果表明,原料样品检测灵敏性可达到0.01%,加工后的食品则可达到0.05%,符合食品成分痕量检测要求.     

中药材羌活鱼引物特异性PCR鉴定

应用引物特异性PCR技术的原理和方法,根据已有Cyt b基因DNA序列的比对结果,设计可以特异扩增羌活鱼源动物包括山溪鲵属Batrachuperus的全部物种的PCR引物1对,SXNS1(上游引物)5′-GGGTCTGCTTAATCTCACAAATTAT-3′,SXNS2(下游引物)5′-CAATTA AAAATGGGAATAAGAAATG-3′.结果表明该对引物可以用于正品羌活鱼和混伪品的分子鉴定.     

青鳉DMY基因的克隆及其在性别鉴定中的应用

提取雄性青鳉成鱼基因组DNA为模板,利用特异性引物,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得1 908 bp的特异性条带.经测序证明为DMY基因片段,其核苷酸序列由3个外显子和2个内含子组成,可连续编码150个氨基酸.建立准确而有效的鉴定任意发育阶段青鳉个体雌雄性别基因型的方法,即利用管家基因——肌动蛋白基因PCR扩增条带的有无验证DNA样本提取和PCR扩增的有效性,同时利用雄性DMY基因的PCR扩增条带的有无鉴定青鳉个体的雌雄性别.对随机选取的成鱼和新生鱼卵样本,应用该方法可成功地鉴定出青鳉个体的雌雄性别.     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3CFU/mL;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8CFU/mL。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

栽培参及其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究

目的探讨人参及其伪品的基因组特异性片段特征,建立人参与伪品的脱氧核糖核酸(DNA)指纹鉴定方法.方法采用CTAB-SDS结合法提取人参及伪品基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA纯度,设计特异性引物,并使用该引物对人参及其伪品DNA进行PCR扩增.结果人参与伪品提取出的基因组DNA大于23 kb,其纯度为1.70±0.19,并且人参能扩增出194 bp大小的片段,而其伪品未能扩增出相应片段.结论人参DNA片段具有特异性指纹特征,可作为人参与其伪品鉴定的有效方法,方法简便,结果可靠.     

基于兼并引物的PCR扩增特定基因的效果比较

根据NCBI上的DNA拓扑异构酶Ⅱ基因序列设计兼并引物,采用常规PCR、降落PCR、巢式PCR三种方法扩增糙皮侧耳和阿魏侧耳的拓扑异构酶Ⅱ部分基因序列,比较三种方法扩增效果的特异性、灵敏度.结果表明,巢式PCR的灵敏度和特异性都优于常规PCR和降落PCR,并且巢式PCR的灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍以上,更加适合兼并引物扩增.这对利用兼并引物获取特异基因具有指导意义.     

应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

应用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)技术建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157三种致病菌的高通量简易检测方法.实验分别以沙门氏菌的inv A基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfb E基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了TemPCR检测方法.结果表明,建立的Tem-PCR方法特异性强,其检测灵敏度分别为沙门氏菌1.1×103CFU/m L、单核细胞增生李斯特氏菌5.6×102CFU/m L、大肠埃希氏菌O157 2.3×103CFU/m L.方法不需要优化调整各引物对的浓度,易于使用,有效地解决了传统多重PCR方法扩增效率不均衡的问题.     

单因子和正交设计法建立分枝杆菌多重PCR体系

为了建立一种快速区分鉴定结核与非结核分枝杆菌的多重PCR方法,以分支杆菌属特异基因32kD,结核分枝杆菌种特异基因MTP40和结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110为目标基因,设计合成3对特异性引物,以结核分枝杆菌标准株DNA为模板,通过对PCR反应体系中DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度5个因素的正交设计,以及PCR反应条件中各反应参数的优化,建立了鉴别分支杆菌的多重PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行了验证。结果显示:该方法对结核分枝杆菌标准株H37Ra能扩增出506、396和984bp,对卡介苗(BCG)能扩增出506和984bp片段,对禽分支杆菌、胞内分支杆菌、偶发分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌能够扩增出506bp片段,对大肠杆菌等的扩增结果均为阴性。建立的多重PCR敏感度最低可检出6.6×10-6 ng。结论:该方法具有特异性高、敏感性好等特点,可用于奶牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别诊断。     

实时荧光PCR技术检测致敏原小麦的研究

采用实时荧光PCR技术检测致敏原小麦成分.试验结果表明:采用小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的特异性检测引物和探针进行检测时,26种样品经实时PCR扩增,只有小麦产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号.灵敏度试验结果表明:该方法对小麦致敏原基因的检测灵敏度较高,可达到1 mg.kg-1,符合痕量检测要求.