重组VEGF-A_189发酵、纯化及鉴定

为了获得大量重组血管内皮生长因子(VEGF-A_(189))蛋白的可溶性表达,对重组VEGF-A_(189)工程菌进行发酵条件的优化并开展发酵研究.通过摇瓶培养进行可溶性发酵条件优化,在5 L发酵罐中发酵重组VEGF-A_(189)工程菌,将发酵产物经镍离子柱亲和层析纯化,并对发酵产物进行SDS-PAGE,Western Blot和ELISA等分析鉴定.结果表明,重组VEGF-A_(189)工程菌可溶性发酵条件为:37℃培养重组VEGF-A_(189)工程菌4 h,加入0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于28℃诱导表达4 h.在5 L发酵罐中按比例放大发酵,在补料发酵3.5 h后菌体密度(A_(600nm))达到8.0,调整发酵温度到28℃,IPTG诱导4 h后的菌体密度为13.72,菌体产量为40 g/L.镍离子柱亲合层析纯化后重组VEGF-A_(189)纯度达到90%以上,回收率大于80%,Western Blot、ELISA分析结果显示,重组VEGF-A_(189)蛋白和抗VEGF抗体有良好的结合活性.结果表明经过发酵条件优化后发酵可获得有免疫结合活性的可溶性重组VEGF-A_(189)蛋白.     

链球菌产磷酸甘油氧化酶的基本特性

介绍了经筛选的链球菌(StreptococcusSP.)产磷酸甘油氧化酶的分离纯化及部分性质的研究.发酵培养液经离心收集菌体,用超声波破碎,40%~75%硫酸铵沉淀法进行粗分级,再通过Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose CL-4B、Chelating Sepharose FF和Sephacryl S-200 HR层析纯化,纯化的磷酸甘油氧化酶在还原、非还原SDS-PAGE中显示单一条蛋白着色带并测得该酶的表观分子质量为67.6 kDa,用HPLC测得其天然状态酶的表观分子质量为     

内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析

采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPICgK，获得的重组质粒pPIC9K-EDN转化毕节酵母GSll5，构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastoris GSll5(pPIC9K-EDN)。SDS-PAGE分析结果显示：人内皮细胞抑制素在重组酵母GSll5(pPIC9K-EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵，经甲醇诱导48h，生物量达到250OD，分泌量为150mg/L，发酵液经SP Streamline，SP Sepharose FF阳离子交换柱和SephamseHeparin Hi Trap柱纯化，产物纯度达到98％。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。     

重组人载脂蛋白AⅠ米兰突变体在酵母中的分泌表达

将重组质粒pPIC9K-apoAⅠ-milano用BglⅡ酶切后转化Pichia pastoris GS115菌株,筛选得到G418高抗性转化子,经甲醇诱导和摇瓶发酵,用SDS-PAGE与Western blot检测上清液,发现有明显的重组人载脂蛋白AⅠ米兰突变体(rAIM)表达,但其分子量比正常蛋白小.对酵母工程菌的摇瓶发酵条件进行优化后,rAIM表达水平得到提高, 约为70 mg/L发酵液,其中正常大小的rAIM所占的比例约为80%.采用冷丙酮沉淀法初步纯化了酵母工程菌发酵液中的rAIM,并验证其有磷脂结合能力.     

人类超氧化物歧化酶在酿酒酵母系统中的高效表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种在生物界广泛存在的抗氧化酶,在抗衰老、抗肿瘤、抗免疫疾病和电磁辐射上都起着重要的作用．对一从人类胎肝cDNA文库中筛到的SOD基因片段进行重组、克隆,并得到带有启动子PADHZ—GAPDH和终止子TADHI的高效稳定的酿酒酵母表达载体pHC11-hSOD．转化酿酒酵母DCO4后获得工程菌DCO4／pHC11-hSOD．表达产物经破壁后SDS-PAGE电泳检测为20ku的条带;酶活性测定结果表明发酵液有40万U／L的hSOD活性．此外,还研究了工程菌的发酵条件和hSOD产物的纯化方法．纯化产物在SDS-PAGE上和Superdex分子筛检测显示,所得产物的纯度已达95％以上．     

苦瓜籽核糖体失活蛋白的基本性质研究

经硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose FF离子交换层析、Blue Sepharose CL-6B亲和层析和Superdex 75分子筛层析从苦瓜籽中纯化出苦瓜核糖体失活蛋白.纯化的蛋白经IEF、梯度PAGE、SDS-PAGE和Periodate-Schiff分析均为单一蛋白着色带或单一糖蛋白着色带.根据SDS-PAGE计算其相对分子量为3.0×104 Da,IEF显示其pI为9.0.N端测序结果为Asp-Val-Ser-Phe-Arg.采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和圆二色谱(CD谱)对纯化RI     

重组鲑鱼降钙素融合蛋白工程菌发酵工艺研究

为研究大肠杆菌表达重组鲑鱼降钙素融合蛋白(GST-sCT-Gly)工程菌的发酵工艺,采用瑞士比欧生物工程公司40 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行优化;在优化条件下,以40 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达到57 g/L,目的蛋白表达量占总蛋白的23.5%;结果表明,研究确定的发酵工艺可以提高工程菌收获量及目的蛋白的表达量,且稳定可靠,可应用于生产。     

产朊圆酵母尿酸酶的分离纯化及其部分性质研究

产朊圆酵母Y0401经尿酸诱导培养,菌体采用超声波处理,依次经过DEAE-Sepharose离子交换层析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析和Xanthine-agarose亲和层析,尿酸酶比活力达到18U/mg,纯化倍数为409倍,回收率为19.2%.纯化后的酶经还原、非还原SDS-PAGE分析为单一蛋白染色带,HPLC显示纯度为98%以上.用HPLC和Superdex 200分子筛层析两种方法测得该酶的相对分子质量为127kDa,在还原条件下进行SDS-PAGE,测得表观分子质量为33kDa,综上结果推测该酶是由分子量相同的4个亚基组成的四聚体蛋白.等电聚焦显示其等电点在6.8~7.5之间.该酶具有较强的酸碱稳定性和热稳定性.最适pH为8.5,最适温度为40.0℃.在最适pH和温度条件下测得该酶Km值为3.34×10-5mol/L.对某些金属离子和有机物对酶活性的影响也进行了研究.     

重组人内皮抑素层析复性的相关研究

研究了由大肠杆菌表达的重组人内皮抑素(Recombinant human endostatin,rhES)的复性、纯化过程.比较先层析复性后纯化(工艺1)和先纯化后层析复性(工艺2)两种工艺的结果表明:工艺1所得rhES的收率和活性回收率分别为64.44%和213.19%,与工艺2相比分别提高8.70%和33.04%.工艺1中,研究了3种凝胶过滤柱复性及复性pH和上样蛋白浓度对复性的影响,并优化相关工艺.结果表明:在pH9.0,rhES浓度3.91 mg/mL的条件下,采用双梯度凝胶过滤Sephacryl S-100 HR进行层析复性,Sephadex G-25脱盐后,用SP Sepharose FF阳离子交换吸附纯化,获得活性回收率为213.19%,HPLC纯度为97.07%的rhES,其IC50为1.58 ug/mL.     

突变芳香基硫酸酯酶H260L工程菌的发酵条件优化

通过摇瓶培养对突变芳香基硫酸酯酶H260L工程菌的发酵条件进行初步优化,研究不同发酵条件包括接种量、诱导时期、诱导剂浓度、发酵时间、诱导剂加入方式、发酵温度及培养基初始pH值对重组芳香基硫酸酯酶表达的影响。结果表明,重组芳香基硫酸酯酶工程菌发酵的乳糖诱导表达优化条件为:以5%接种量培养3 h后,加入乳糖诱导剂至5 g/L,诱导表达7 h;当发酵温度为25℃、培养基的初始pH值为7.5时,重组芳香基硫酸酯酶活性最高。在优化条件下,工程菌芳香基硫酸酯酶活性达到2.63 U/m L,是未优化酶活性的46.9倍。突变酶H260L对龙须菜粗多糖硫酸基团的脱硫率为82.1%。     

重组毕赤酵母发酵甘油制备α-葡聚糖酶的研究

【目的】考察甘油对组成型毕赤酵母（Pichiapastoris ）生长和α-葡聚糖酶表达量的影响。【方法】采用单因素实验法考察初始发酵培养基中甘油浓度、补料阶段甘油残留和通气量等对α-葡聚糖酶表达量的影响。【结果】发酵培养基中初始甘油浓度从50 g／L提高到150 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量均未受到影响,继续提高到200 g／L时,α-葡聚糖酶表达量明显下降。补料过程甘油残留在0～5 g／L,菌体生长和α-葡聚糖酶表达量最佳,当甘油残留较多时,菌体生长和α-葡聚糖酶的表达量均受到影响。提高通气量有利于增加α-葡聚糖酶的表达量,发酵78 h为宜,在此条件下α-葡聚糖酶酶活力达1763 U。【结论】该工艺优化了以甘油作为碳源制备α-葡聚糖酶的发酵条件,提高了α-葡聚糖酶酶活力,为大规模生产α-葡聚糖酶奠定了基础。     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

玫瑰茄西瓜复合果酒的研制

以西瓜和玫瑰茄为主要原料,酿制玫瑰茄西瓜复合果酒。以酒精度和感官评分为评价指标,研究发酵时间、玫瑰茄提取液浓度、酵母添加量和白砂糖添加量对果酒品质的影响,通过响应面法确定复合果酒的最佳配方和发酵工艺条件。结果表明:影响玫瑰茄西瓜复合果酒品质的主要因素是酵母添加量,其次是白砂糖添加量和玫瑰茄提取液浓度,而发酵时间的影响最小。最佳配方和发酵工艺条件为发酵时间77 h、玫瑰茄浸提液浓度为3%、酵母添加量为0.04%、白砂糖添加量为44%(均以西瓜汁重量计)。经单宁、果胶澄清处理后的复合果酒,色泽为淡黄色,酒体澄清透明,微酸爽口自然,酒精度为8.33%Vol。     

衣康酸生产菌株土曲霉QD-1发酵工艺的研究

筛选得到衣康酸生产菌株土曲霉QD 1,对其适宜的发酵工艺条件进行了研究。确定了最佳种龄、接种量和发酵最适初始pH。通过正交试验确定了最适发酵培养基组成,并对发酵过程中衣康酸生成 、菌体生长和糖的消耗规律进行了分析。     

娄彻氏链霉菌发酵改善水稻秸秆加工性能的研究

【目的】应用正交试验,研究了娄彻氏链霉菌发酵对水稻秸秆加工性能的影响。【方法】在30℃、含水率为65%的条件下,探究了发酵时间、接种量、碳氮比3因素对水稻秸秆质量损失率,纤维素、半纤维素和木质素的降解率,以及最大压应力和黏度(加工性能)的影响,并利用SPSS 19.0软件分析了降解条件与水稻秸秆理化性能的相关性。【结果】娄彻氏链霉菌发酵条件对水稻秸秆的降解性与加工性能的影响顺序为:发酵时间碳氮比接种量;通过相关性分析可得,发酵时间与纤维素、半纤维素和木质素的降解率以及质量损失率极显著正相关,与秸秆的最大压应力和黏度显著负相关。发酵的最优条件为:碳氮比为25,接种量为0.8%,发酵时间为20 d。此时水稻秸秆的最大压应力为5.62 MPa,较原秸秆降低了10.74%;黏度为415.8 m Pa"s,较原秸秆提高了29.7%;平衡扭矩则降低了18.2%。微观结构(SEM)显示发酵后水稻秸秆表面粗糙、凹凸不平,内部结构发生了变化。【结论】娄彻氏链霉菌发酵改变了水稻秸秆的物理化学结构,改善了水稻秸秆的加工性能。     

L-亮氨酸补料分批发酵研究

对补料方式、补料速度等发酵过程的各种参数，以及产酸率、转化率、发酵周期等的影响和补料分批发酵条件进行了研究，确定了L-亮氨酸补料分批发酵的最优条件。在最优补料分批发酵条件下，10L罐L-亮氨酸产量达29．47g/L，糖酸转化率达21．47％，结果明显优于分批发酵。     

麦麸米糠混合发酵生产红曲色素条件的研究

以廉价农产品废弃物麦麸和米糠为原料,通过单因素试验,正交试验和附加碳、氮源及微量元素试验,研究了接种量、发酵温度和发酵时间对红曲SM01色素产量的影响。确定了红曲SM01的最佳发酵条件为接种量13%,发酵温度30℃,发酵时间10 d;最佳附加方案为葡萄糖+硝酸铵+甘油+ KH2PO4+ MgSO4。 在上述培养条件下,以低成本的麦麸、米糠、葡萄糖、硝酸铵、甘油及微量元素混合物来代替大米培养红曲霉,色价高达3 789 U/g,降低了约30%的生产成本。     

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。