融合表面抗SA-28基因在Pichia Pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原S-preS1融合基因SA-28插入质粒载体pAO815的EcoR Ⅰ位点中,将其置于Pichia Pastoris酵母AOX1启动子控制下.利用电转化技术,融合基因表达单元连同HIS4基因被整合到受体菌SMD1168基因组中.对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明:SA-28基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;SA-28融合基因的表达产物具有S和PreS1的双重抗原性.用CsC1密度梯度离心法纯化了表达产物,融合抗原活性峰位于密度为1.19 mg/cm3的区带.     

甜蛋白Monellin在巴斯德毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的Monellin基因片段插入Pichia pastoris胞内表达质粒Ppic3.5k‘，然后转入Pichia pastoris SMD 1168受体菌中，用G418筛选高拷贝菌株，并进一步对其进行PCR鉴定，获得的阳性克隆菌株经甲醇诱导60h，SDS-PAGE结果显示菌株破壁液中含有表达的Monellin，其大小约为11ku，并具有甜度。     

转甲状腺素蛋白基在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK-TTR质粒上TTR基因切下，分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K，将重组的pPIC9K-TTR用BglⅡ酶切后，转化pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子，转化子经摇瓶发酵，上清液用SDS-PAGE检测，有明显的rTTR表达，经DEAE-sepharose F.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析，得到蛋白线纯度大于95%的rTTR，经Western Boltting，分子质量和等电点测定等证明，毕赤氏酵母的表达rTTR与人血浆提取的TTR极为相似。     

α2b干扰素基因与Ag85B基因在毕赤氏酵母中的融合表达

Ag85是结核分枝杆菌的一种分枝菌酸转移酶复合体,在结核分枝杆菌的细胞壁合成过程中起着重要作用Ag85B是该复合体的一个组分,具有较好的免疫原性通过连接多肽（G4S）4的编码序列,将α2b干扰素基因与Ag85B基因连成融合基因,然后克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9上,转化Pichia pastoris SMD1168后获得重组酵母工程菌SMD1168／pPIC9-α2bAg85B,经甲醇诱导培养,发酵上清液经抗病毒活性测定,Western blot鉴定以及初步纯化,结果表明,分泌表达的融合蛋白具有一定的抗病毒活性．     

人类超氧化物歧化酶在酿酒酵母系统中的高效表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种在生物界广泛存在的抗氧化酶,在抗衰老、抗肿瘤、抗免疫疾病和电磁辐射上都起着重要的作用．对一从人类胎肝cDNA文库中筛到的SOD基因片段进行重组、克隆,并得到带有启动子PADHZ—GAPDH和终止子TADHI的高效稳定的酿酒酵母表达载体pHC11-hSOD．转化酿酒酵母DCO4后获得工程菌DCO4／pHC11-hSOD．表达产物经破壁后SDS-PAGE电泳检测为20ku的条带;酶活性测定结果表明发酵液有40万U／L的hSOD活性．此外,还研究了工程菌的发酵条件和hSOD产物的纯化方法．纯化产物在SDS-PAGE上和Superdex分子筛检测显示,所得产物的纯度已达95％以上．     

转甲状腺素蛋白基因在毕赤氏酵母中的非融合表达

用限制酶将pSK TTR质粒上TTR基因切下,分别插入分泌型载体pPIC9和pPIC9K.将重组的pPIC9K TTR用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子.转化子经摇瓶发酵,上清液用SDS PAGE检测,有明显的rTTR表达.经DEAE sepharoseF.F.离子交换柱和Superdex75分子筛层析,得到蛋白纯度大于95%的rTTR.经Westernblotting,分子质量和等电点测定等证明,毕赤氏酵母表达的rTTR与人血浆提取的TTR极为相似.     

乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达

以酵母载体ＹＦＤ５９为基础,将乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因正向插入组成型启动子ＰＰＧＫ１及终止子ＴＰＧＫ１间,得到表达载体ＹＦＤ５９－ＬＳＳ１。并将该表达载体分别转化ＢＪ２１６８,ＤＢＹ７４６,ＪＲＹ１８８,ＢＪ３５０５ ４株不同的酿酒酵母株。再将ＹＦＤ５９－ＬＳＳＩ质粒上的表达单元克隆至高稳定载体ｐＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点,构建成３个带有不同拷贝数和不同插入方向表达单元的表达载体;ｐＨＣ１     

产分泌蛋白酶酵母菌株的筛选

用含有脱脂奶粉平板上点种培养的方法,从分属９３个属,４９２个种的２１２９０个酵母菌株中进行筛选,发现有分属２７个属,８７个种的１６５个酵母菌株可产一不同程度的分泌蛋白酶,并对其中３株产酶较高的菌株进行培养基对产酶量的研究。     

αA干扰素基因在酿酒酵母中的表达

将含有αA干扰素基因的DNA片段接上化学合成的EcoR I-Hind III转换接头,然后插入酵母分泌型表达载体YFD 18中,构建成质粒YFD 66和YFD66-0.转化酵母菌BJl991后,得到转化子BJ1991/YFD66和BJl991/YFD66-0.干扰素活性测定表明,每升BJ1991/YFD66培养液含有αA干扰素10~6U,而BJ1991/YFD66-0则不产生干扰素,YFD66为αA干扰素表达质粒。     

单链莫奈林基因表达载体的构建及其分泌表达

根据甜蛋白莫奈林的氨基酸序列，选择酵母偏爱密码子，化学合成单链莫奈林(Single-Chain Monellin，SCM)基因片段，并拼接成全基因．基因的DNA序列分析表明，合成的单链莫奈林基因与设计的一致．该基因插入于毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中置于AOXI启动子的控制下，并通过电转化技术将重组质粒pPIC9K／SCM导入Pichia pastoris，在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子．转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达，用SDS-PAGE检测发酵液，表明SCM的分泌表达蛋白可达发酵液蛋白含量的90％．