2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33 ofs N-片段基因敲除株的构建

通过生物信息学分析2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype 2,S．suis2）中国强毒株05ZYH33的基凶组,预测并发现猪链球菌血清浑浊因子（Opacityfactor of S．suis,OFS）的编码基因ofs.为了构建ofsN-末端片段ofs^37-683的基因敲除株,首先构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为ofs^37-683上、下游同源序列的基因敲除质粒,并对该质粒进行PCR和酶切鉴定．根据同源重组的原理,通过电转化方法筛选得到ofs^37-683基因敲除株．PCR、测序和RT—PCR分析结果均显示ofs^37-683已完全被壮观霉素抗性基因替代,证实ofs^37-683基因敲除株构建成功．该敲除株的获得为进一步研究ofs在猪链球菌2型致病机制中的作用奠定基础．     

r结核分枝杆菌PhoP／PhoR基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定

为构建结核杆菌PhoPR双组分系统PhoP、PhoR基因的重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR并对其进行鉴定。采用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA为模版,利用PCR技术分别扩增PhoP、PhoR基因编码序列,先克隆于T—Vector pMD19（Simple）,再亚克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取所得的阳性克隆子获得重组表达质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,通过PCR及双酶切鉴定。结果显示,结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA中扩增出的PhoP、PhoR基因与GenBank公布的序列一致,经过PCR及双酶切鉴定,表明PhoP、PhoR基因均成功插入了pMV361穿梭载体。由此可知,成功构建了重组穿梭质粒pMV361-PhoP、pMV361-PhoR,为进一步研究PhoPR双组分系统奠定了基础。     

BCR/ABL和SEA双基因重组载体的构建和表达

目的:构建和表达含BCR/ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒.方法:利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR/ABL融合位点基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点A和B上,构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA- pIRES-BCR/ABL重组质粒.将重组质粒转染K293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒在真核细胞的转录情况, SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在真核细胞的表达.结果:成功扩增出BCR/ABL和 SEA基因片段;双酶切鉴定BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒中含有BCR/ABL和SEA基因,测序证实完全正确;将重组质粒转染K293细胞后,经 RT-PCR扩增鉴定,插入到重组质粒的BCR/ABL和SEA基因能在真核细胞正常转录,经SDS-PAGE电泳鉴定重组质粒能够在真核细胞中表达BCR/ABL和SEA蛋白.结论:成功构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL真核双表达质粒,可在真核细胞中正常转录并表达BCR/ABL和SEA蛋白.     

运动发酵单胞菌RecET重组系统的构建及应用

为了提高外源基因整合到染色体的效率,在已构建的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体基础上,构建了RecET表达质粒pSUZM3a-RecET.选取乙醇脱氢酶Ⅰ(adhA)基因作为靶基因,四环素抗性基因(Tcr)作为筛选标记基因,检测RecET重组系统在Z.mobilis中进行基因重组的可行性.将两端带有60bp adhA基因同源臂的四环素抗性基因片段电击转化含有RecET重组系统表达质粒的运动发酵单胞菌ZM4,获得adhA基因缺失突变菌株.对突变菌株adhA基因的PCR产物进行测序发现,adhA基因已被置换为四环素抗性基因.上述结果表明:RecET重组系统在运动发酵单胞菌中具有高效、便捷和可操作性,只需60bp同源臂即可完成同源重组.     

结核分枝杆菌标准株mazEF6缺失株的构建

为构建结核分枝杆菌标准株H37Rv毒素-抗毒素系统maz EF6基因缺失突变株。采用聚合酶链反应(PCR)技术,分别从H37Rv和PUC-19K质粒上扩增出maz EF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;应用融合PCR技术将maz EF6基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,并将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF6-kan,将构建的自杀质粒转化至大肠杆菌DH5a中;利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中;并将该菌株涂于卡那霉素抗性改良罗氏培养基,培养3-4周后,刮取能在卡那霉素抗性培养基中生长的结核分枝杆菌单个菌落,以提取的阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段,并测序。对所获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变,成功获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株。由此可知,本研究为今后研究毒素-抗毒素系统maz EF6基因的生物学功能奠定基础。     

屎肠球菌hyl基因突变株的构建

目的：构建屎肠球菌类透明质酸酶（hyaluronidase,hyl）基因突变株,研究hyl基因的功能。方法：用pETX4577质粒构建屎肠球菌hyl基因重组自杀质粒,通过体内同源重组,筛选获得hyl基因的突变株,体外研究hyl基因缺失对突变株生长能力的影响。结果：经同源重组,利用卡那霉素抗性筛选,PCR、脉冲场电泳和southern blot进行鉴定获得基因突变株＊hyl。突变株在体外的生长能力低于野生株。结论：hyl基因突变株构建成功,hyl基因在生长中起着重要的作用,可能是屎肠球菌的毒力因子之一。     

胸膜肺炎放线杆菌Δlip40回复突变株的构建及鉴定

胸膜肺炎放线杆菌(APP)可引起猪胸膜肺炎,在一定程度上阻碍了养猪业的发展.目前,APP基因组中已得到有效鉴定的基因不足10%.为建立有效的APP功能基因研究体系,本文以前期构建的血清1型APP SLW01株外膜脂蛋白基因缺失突变株Δlip40为亲本,通过电转化法将携带有完整lip40基因的穿梭质粒pJFF-lip40导入Δlip40中,通过氯霉素抗性筛选获得回复突变株CΔlip40.对CΔlip40的生物学特性进行了初步分析发现,穿梭质粒可在APP中稳定遗传,并且APP生长能力未受穿梭质粒转入的影响.此外,SLW01和Δlip40对氯霉素高度敏感,但回复突变株CΔlip40较前两种菌株对氯霉素抗性明显增强,表明穿梭质粒pJFF224-XN抗性基因可在APP菌株中稳定表达.回复突变株CΔlip40的成功构建为分析脂蛋白Lip40致病机制提供了有效对照材料,本研究中建立的互补菌株构建系统以及APP抗性评价方法将有助于今后深入研究APP生物学特性及基因功能.     

卡介苗Hsp16.3基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7自噬的影响*

构建及鉴定卡介苗(BCG)Hsp16.3基因突变株,观察该突变株对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增Hsp16.3基因两侧分子量分别为663 bp和684 bp的两个DNA片段,并将这两个目的片段分别插入p KO载体上相应的位点。通过硫酸卡那霉素筛选,利用双酶切以及测序的方法,获得阳性重组质粒p KO-Hsp16.3。将阳性重组质粒p KO-Hsp16.3电转入BCG感受态细胞中,经过硫酸卡那霉素和蔗糖两次筛选,得到BCG Hsp16.3基因突变株。将筛选培养的BCG Hsp16.3突变株用于小鼠巨噬细胞的感染实验,并通过Western Blot和细胞免疫荧光技术对自噬相关蛋白的表达水平的变化进行观察及分析。成功获得重组质粒p KO-Hsp16.3的阳性克隆;电转化该重组质粒,并经过硫酸卡那霉素筛选和蔗糖反筛选,成功得到BCG Hsp16.3基因突变株。通过Western Blot以及免疫荧光分析发现,BCG Hsp16.3基因的突变株促进了小鼠巨噬细胞自噬的发生。     

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

林可霉素生物合成基因lmbU的敲除及其遗传回补

利用DNA同源重组原理敲除S.lincolnensis NRRL 2936中lmbU基因,筛选获得该基因缺陷株S.lincolnensis JLUa2,其不具备林可霉素生物合成能力.利用构建的不同重组质粒转化缺陷株,发现含有质粒pHBUYX335的缺陷株重新获得了林可霉素生物合成能力.单一回补下游基因lmbY和lmbX不能使缺陷株重新恢复林可霉素合成能力;而同时回补lmbU基因和下游基因lmbY和lmbX却能回补这种缺陷,缺陷株林可霉素合成能力的丧失不仅是由下游基因的破坏而引起,证实了lmbU基因是林可霉素生物合成的关键基因.根据不同重组质粒上装载的基因片段性质推测了lmbU基因可能的启动子.     

鸡缩胆囊素-33四串体的可溶表达及应用研究

根据pRSETA载体序列,设计一对引物,采用PCR技术从重组质粒pRSETA-4CCK33上扩增到鸡缩胆囊素33(cholecystokinin-33,CCK33)四串体基因片段(缩写为4CCK33)。再将4CCK33克隆到原核表达载体pBCX上,成功构建重组质粒pBCX-4CCK33并在大肠杆菌BL21中成功表达,SDS-PAGE检测到分子量约为53 000的融合蛋白,可溶分析表明,融合蛋白主要是以可溶形式表达。Western-blot证实,融合蛋白能与CCK-8阳性血清发生免疫反应。用此纯化的融合蛋白制成油乳剂疫苗,主动免疫肉猪。饲养试验表明,免疫0.5 mg/mL和1.5 mg/mL 4CCK33疫苗的试验肉猪平均日增重与空白对照组相比,分别提高了5.28%和5.92%;日采食量则分别提高3.03%和2.53%,差异显著(P<0.05)。     

获得四环素抗性的温敏同源重组载体质粒pRNT15的构建

 苏云金芽孢杆菌工程菌株TnX对蚊幼虫具有高毒力,但红霉素抗性基因的存在限制了其商品化。根据转座子Tn917载体的基因序列,利用重叠延伸PCR法克隆同源重组序列到pRN5101上得到pRN15,根据pBU4载体上的四环素抗性基因序列,对pRN15进行改造,使其失去红霉素抗性,获得四环素抗性,载体命名为pRNT15。重组载体四环素抗性的获得,使之扩大了使用范围,也为工程菌株染色体中红霉素抗性基因的敲除奠定了基础。     

2型猪链球菌RevS基因敲除突变株生物学特征及致病性研究

比较2型猪链球菌(S.suis 2)ΔRevS突变株和05ZY/H33野生株生物学特性及致病性的差异.首先,通过吸光值测定和革兰染色比较△RevS突变株和05ZY/H33野生株的生长速度和菌体形态.分别对Balb/c及ICR(CD1)小鼠腹腔注射109 CFU·mL~(-1)的05ZY/H33菌液,评估两种品系小鼠对S.suis 2的易感性.分别对Balb/c小鼠腹腔注射2.5×10~9,5.0×10~8,1.0×108,2.0×10~7,4.0×10~6 CFU·mL~(-1)的05ZY/H33菌液,采用Reed法计算半数致死量.对Balb/c小鼠腹腔注射5.0×108 CFU·mL~(-1)的ΔRevS突变株和05ZY/H33野生株菌液,观察野生株和突变株对小鼠的影响.对仔猪耳缘静脉注射10~9 CFU·mL~(-1)的05ZY/H33野生株和ΔRevS突变株菌液,观察野生株和突变株对仔猪的影响.体外生物学特征分析表明,与野生株相比,突变株的生长速率和形态染色并未发现显著变化;Balb/c小鼠对S.suis 2 05ZY/H33的敏感性高于ICR(CD1)小鼠,05ZY/H33对Balb/c小鼠的LD50为4.2×10~7 CFU·mL~(-1).Balb/c小鼠攻毒试验结果显示,ΔRevS对小鼠的致病性明显减弱.仔猪攻毒试验结果显示,野生株和突变株都引发仔猪全部死亡,但ΔRevS引发仔猪死亡时间较晚.△RevS突变株保持了菌株的基本生物学特征,但对小鼠和仔猪两种动物模型的致病作用差异较大.     

嗜线虫致病杆菌抗生素基因簇克隆及遗传体系建立

【目的】嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus)是昆虫病原线虫的共生菌,研究此共生菌分泌的抗菌活性的次级代谢产物基因蔟信息。【方法】通过直接PCR将目的基因簇分为数段扩增,利用天然酵母重组系统实现体外重组;同时采用果聚糖蔗糖转移酶基因sacB负筛选系统,通过两次同源臂重组构建基因敲除突变株,建立嗜线虫致病杆菌DSM 16338的遗传操作系统。【结果】成功获得推测目的基因簇;缺失所推测基因簇的3个相连基因,筛选到大片段缺失突变株GW2及调控基因敲除突变株GW4。【结论】利用高效的直接克隆方法获得了基因簇,成功对DSM 16338推测基因簇完成了基因中断,建立了该菌的遗传操作系统,为阐述此类细菌天然产物的生物化学多样性奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的构建研究

为了构建单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)ncRNA rli60基因缺失株,采用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法成功构建具有氯霉素抗性的pKSV7-Δrli60穿梭质粒,然后电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力下进行同源重组,通过PCR进行重组菌鉴定。结果表明:成功筛选得到遗传性稳定的LM ncRNA rli60基因缺失株,为揭示LM ncRNA rli60基因功能提供了研究材料;同时,为进一步研究其在LM致病性及环境应激中的分子机制奠定了基础。     

rDNA介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用

根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增特定的2．2kb rDNA片段,并以此替换酿酒酵母(Saccharomyces cereristae)整合载体YIp5的URA3片段;在此基础上,引入G418抗性基因KanMX和酵母磷酸甘油激酶(phosphoglycerale kinase,PGK)组成型强启动子和终止子序列(PGKp-t),构建适合酿酒酵母工业菌株高拷贝整合表达载体pYMIKP,以细菌木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xy/A为目标基因,通过载体pYMIKP引入到酵母工业菌株NAN-27中,酵母转化子在非选择培养条件下,连续生长50世代质粒稳定性为99．72％,目标基因高拷贝重组菌的木糖异构酶比酶活是对照菌株的67．2倍,达到0．672U／mg蛋白,实现了外源基因在酿酒酵母工业菌株中的稳定高效表达。     

花鳗鲡重组促黄体生成素在毕赤酵母中的表达

 采用聚合酶链反应从花鳗鲡垂体cDNA中分别扩增出GTHα、LHβ基因,再利用搭桥技术,中间以linker将两个基因连接成单个基因LHβα。然后利用双酶切、连接,将LHβα基因连接到载体pPICZαA中,构建出促黄体生成素的酵母共表达载体pPICZαA-LHβα。再利用电转化法将其转入到酵母野生型菌株X-33中,在含不同浓度的zeocinYPDS平板上筛选高拷贝转化子,阳性克隆经φ=0.7%甲醇诱导表达,表达产物采用SDS-PAGE和western blot进行分析,得到所表达的产物相对分子质量约为45 000。     

Construction of the glucose isomerase deficient strain ofStreptomyces M1033 by homologous recombination

After the establishment of the transformation conditions ofStreptomyces diastaticus No.7 Strain M1033, the integration plasmid pXW for homologous recombination, which contains a 600 bp fragment of incompleteGI (G138P. G247D) gene, has been constructed in order to realize the stable overexpression of theGI (G138P. G247D) which is valuable for large-scale industrial production. The Gigene’s disruption has been realized by pXW’s integration into M1033 chromosomes via homologous recombination andGI deficient strain ofStreptomyces M1033 has been obtained. The reliability of introduction of mutation has been proved by analysis of recombinant fragment and affirmance of existence of the mutation, as well as detection of the stability of the deficient strain.     

利用PCR产物一步法敲除大肠埃希菌的外排泵基因acrAB

通过电转化将一段PCR产物引入宿主菌BW25113/pIJ790细胞内,PCR产物两端有与染色体同源的30个核苷酸序列,中间是抗生素抗性基因。pIJ790上编码λ噬菌体的3个重组蛋白:Exo、Bet和Gam组成Red重组系统,可实现线性片段的一步法高效重组,以PCR产物中的抗生素抗性基因取代靶基因。通过该方法得到了大肠埃希菌的外排泵基因acrAB敲除突变株,该菌株在抗菌物质的抗菌机制研究方面能发挥一定的作用。