弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

Sry基因的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pCR3.1-Sry.并检验其在真核细胞内的表达.方法:用PCR法从小鼠基因组中扩增出Sty全长基因,重组入pMD18-T载体,酶切鉴定重组质粒,对酶切正确的重组质粒测序.双酶切测序验证的重组质粒.将切下的片段与真核表达质粒pCR3.1相连构建pCR3.1-Sty重组质粒.将其转染HeLa细胞后,RT-PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA的转录;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白质的表达.结果:PCR法扩增得到了1.2 kb的特异性Sry基因片段;成功地构建了真核表达重组质粒pCR3.1-Sry;重组质粒pCR3.1-Sry在HeLa细胞中mRNA及蛋白水平均可检测到表达.结论:重组质粒构建成功并可以在体外真核细胞中表达,为进一步研究其作为核酸疫茁的免疫作用提供了可控的实验材料.     

柔嫩艾美耳球虫Serpin基因在293T细胞中的表达

为了检测柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,Serpin)基因(EtSerpin)在真核细胞293T中的表达情况,以Et孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增含完整Serpin开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtSerpin质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtSerpin.该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞,用间接免疫荧光法和Western blot鉴定EtSerpin基因的表达情况,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光,Western blot结果显示出大小约45.5kDa的目的蛋白条带,结果表明构建的EtSerpin可以在293T细胞中获得表达.     

大鼠csrp2基因真核表达质粒的构建及表达

获得大鼠csrp2,基因片段并构建真核表达载体.RT-PCR法从大鼠心脏组织中提取总 DNA,并扩增出相应大小的csrp2 DNA片段,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染Cos-7细胞,分别以RT-PCR 方法检测mRN-表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pcDNA 3.1(-)-csrp2,RTPCR结果证明csrp2,可在cos-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有CRP2蛋白的细胞着染.成功构建了大鼠csrp2基因的真核表达载体pcDNA 3.1(-)-csrp2,csrp2,基因可以在Cos-7细胞中表达.     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达质粒的构建及表达

构建结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达载体.PCR扩增Rv2450基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1（-）,重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pCDNA-Rv2450,RT-PCR结果证明Rv2450可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv2450蛋白的细胞着染.成功构建了结核分枝杆菌Rv2450基因的真核表达载体pCDNA-Rv2450,Rv2450基因可以在P815细胞中表达.     

N-RasG12D基因突变体真核表达载体的构建及其鉴定

通过PCR法扩增出N-Ras基因突变体片段,将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP中。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果证实所构建的N-RasG12D基因突变体逆转录病毒载体目的基因序列完全正确,并能够在293T细胞中能瞬时表达。重组真核质粒的构建及表达为深入研究N-ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。     

人全长Notch1基因的克隆及其在HEK293 T细胞中的表达

目的:克隆人全长Notch1基因,构建人全长Notch1/p CMV6-Entry真核重组质粒并在HEK293 T细胞中进行瞬时表达.方法:采用PCR公知不认方法扩增人全长Notch1基因并克隆到真核表达载体p CMV6-Entry中并用限制性内切酶分析和DNA测序鉴定重组质粒.将该重组质粒转染HEK293 T细胞24h后,通过实时荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测鉴定人全长Notch1的表达.结果:成功构建了人Notch1/p CMV6-Entry重组真核表达质粒,人全长Notch1基因在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于p CMV6-Entry载体对照组和HEK293 T细胞对照组.结论:克隆获得人全长Notch1基因并验证在HEK293 T细胞中表达.     

pegfp/glur6重组表达载体的构建

目的：构建pegfp/glur6重组表达载体。方法：用基因重组技术构建pegfp/glur6重组表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜检测。结果：经酶切和PCR鉴定重组质粒pegfp/glur6重组表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜显示融合蛋白在细胞中表达。结论：基因重组技术成功构建pegfp/glur6重组体。     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

拟南芥基因倍增及基因流失分析

基因倍增指基因组中含有基因的DNA片段复制出一个或更多拷贝的过程，是进化出新物种的主要原因。采用新的数据和方法研究拟南芥基因组的基因倍增过程，通过分析串联基因倍增和大规模基因倍增的存在比例和同义置换率分布，并估计大规模倍增后基因流失的比例，揭示了拟南芥基因组一次非常明显的全基因组倍增，采用科学的方法估计这次倍增发生在约8000万年前。比较该结果与之前的研究，提出了一种解释拟南芥基因倍增过程更合理的模型。     

拟南芥基因倍增及基因流失分析

基因倍增指基因组中含有基因的DNA片段复制出一个或更多拷贝的过程，是进化出新物种的主要原因。采用新的数据和方法研究拟南芥基因组的基因倍增过程，通过分析串联基因倍增和大规模基因倍增的存在比例和同义置换率分布，并估计大规模倍增后基因流失的比例，揭示了拟南芥基因组一次非常明显的全基因组倍增，采用科学的方法估计这次倍增发生在约8000万年前。比较该结果与之前的研究，提出了一种解释拟南芥基因倍增过程更合理的模型。     

优质肉鸡ADSL及GART基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术对大恒鸡S01品系共计300只鸡的ADSL及GART基因进行多态性分析,结果显示：ADSL基因第9个外显子存在一个SNP位点,测序结果显示其纯合子CC与TT相比有一个C10191T的单碱基突变;GART基因在5’侧翼序列存一个SNP位点,其纯合子AA与BB相比有一个C153T单碱基突变,采用独立性x2分析发现,ADSL及GART基因都达到Hardy-Weinberg平衡.     

Proto-genes and de novo gene birth

Novel protein-coding genes can arise either through re-organization of pre-existing genes or de novo. Processes involving re-organization of pre-existing genes, notably after gene duplication, have been extensively described. In contrast, de novo gene birth remains poorly understood, mainly because translation of sequences devoid of genes, or 'non-genic' sequences, is expected to produce insignificant polypeptides rather than proteins with specific biological functions. Here we formalize an evolutionary model according to which functional genes evolve de novo through transitory proto-genes generated by widespread translational activity in non-genic sequences. Testing this model at the genome scale in Saccharomyces cerevisiae, we detect translation of hundreds of short species-specific open reading frames (ORFs) located in non-genic sequences. These translation events seem to provide adaptive potential, as suggested by their differential regulation upon stress and by signatures of retention by natural selection. In line with our model, we establish that S. cerevisiae ORFs can be placed within an evolutionary continuum ranging from non-genic sequences to genes. We identify ~1,900 candidate proto-genes among S. cerevisiae ORFs and find that de novo gene birth from such a reservoir may be more prevalent than sporadic gene duplication. Our work illustrates that evolution exploits seemingly dispensable sequences to generate adaptive functional innovation.     

Investigation of gene expression profiles in coronary heart disease and functional analysis of target gene

The research outlined here includes constitution of the differential gene expression profile by means of oligonucleotide gene microarray and functional analysis of the target gene for coronary heart disease (CHD). In a microarray screening experiment, the predominance of inflammation- and immune-related genes is presented in the expression profile of 107 differential genes based on the analysis of gene ontology and gene pathway. IL-8, an inflammatory factor, is identified as one of the genes that were markedly up-regulated in CHD. The plasma level of IL-8 is significantly raised in patients with CHD (n = 30) compared with healthy controls (n = 40), which underscores the clinical relevance of the in vitro finding. The further functional analysis shows that IL-8 affects platelet aggregation percentage, expression of CD62p and platelet aggregation morphology in 12 healthy volunteers to some extent. These findings suggest the relevance of inflammation and immune responses to CHD at the DNA level. Moreover, IL-8 may be involved in the pathogenesis of CHD through the pathway of platelet activation. Supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 90409021)