获得四环素抗性的温敏同源重组载体质粒pRNT15的构建

苏云金芽孢杆菌工程菌株TnX对蚊幼虫具有高毒力,但红霉素抗性基因的存在限制了其商品化.根据转座子Tn917载体的基因序列,利用重叠延伸PCR法克隆同源重组序列到pRN5101上得到pRN15,根据pBU4载体上的四环素抗性基因序列,对pRN15进行改造,使其失去红霉素抗性,获得四环素抗性,载体命名为pRNT15.重组载体四环素抗性的获得,使之扩大了使用范围,也为工程菌株染色体中红霉素抗性基因的敲除奠定了基础.     

乳酸乳球菌nisin抗性基因的克隆及作为筛选标记的研究

在添加500U/mL nisin和溴甲酚紫的GM17选择性培养基上,分离到5株nisin抗性菌株。根据形态观察,生理生化特性和16S rDNA基因序列比对被鉴定为乳酸乳球菌。根据已报道nisin抗性基因设计引物,分别以这5株菌的染色体和质粒DNA为模板进行PCR扩增,结果从1株抗性菌株的染色体上得到目的基因产物。通过序列测定和同源性比对,证明为nisin抗性基因（nsr）。将nsr基因克隆到乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pTRKH2上,重组质粒命名为pT-nsr。pT-nsr电转化乳酸乳球菌MG1614,获得的重组菌MG1614/pT-nsr在含有500U/mL nisin的培养基中生长情况良好。这表明nsr基因赋予宿主菌抗nisin特性,并且与红霉素抗性功能相同,因此nsr基因可以作为筛选标记用于食品级载体的构建。     

运动发酵单胞菌RecET重组系统的构建及应用

为了提高外源基因整合到染色体的效率,在已构建的运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体基础上,构建了RecET表达质粒pSUZM3a-RecET.选取乙醇脱氢酶Ⅰ(adhA)基因作为靶基因,四环素抗性基因(Tcr)作为筛选标记基因,检测RecET重组系统在Z.mobilis中进行基因重组的可行性.将两端带有60bp adhA基因同源臂的四环素抗性基因片段电击转化含有RecET重组系统表达质粒的运动发酵单胞菌ZM4,获得adhA基因缺失突变菌株.对突变菌株adhA基因的PCR产物进行测序发现,adhA基因已被置换为四环素抗性基因.上述结果表明:RecET重组系统在运动发酵单胞菌中具有高效、便捷和可操作性,只需60bp同源臂即可完成同源重组.     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的衍生质粒pAl32的酶谱及抗性基因定位

从短小芽孢杆菌四环素抗性质粒pCJ3截短的衍生质粒pAL32,经用6种限制酶双酶解试验,根据琼脂糖凝胶电泳带估算各片段的分子量,作出了pAL32的6种限制酶图谱。利用已除去复制功能的金黄色葡萄球菌质粒pUB110与pAL32构建的Km~rTc~r的双抗性重组质粒pSC33为载体,在EcoRV位点克隆的λDNA片段的重组子均为Km~rTc~s。用pUB110与pAL32在PvuⅡ位点连接后的重组质粒也为Km~rTc~s。根据这些重组子四环素抗性的失活,推知pAL32上EcoRV与PvuⅡ切点均位于其四环素抗性基因上。     

枯草杆菌启动基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以大肠杆菌启动基因选择载体pHE5为载体,枯草杆菌染色体DNA为供体,克隆了一批启动基因功能片段,带克隆片段的重组质粒在大肠杆菌中表现不同的四环素抗性水平,其中50%在100μg/ml以上,12%达到200μg/ml。对其中一个转化子进行质粒检测和分析,获得一个重组质粒pHE273,经酶切分析证明,克隆的强启动基因位于2.2kb的EcoRI-HindⅢ片段上。     

人源温和气单胞菌溶血素基因的克隆与表达

根据GenBank报道的人源温和气单胞菌溶血素(hly)基因序列设计引物,经PCR扩增,得到大小约为1470bp的阳性产物.利用BamHⅠ,HindⅢ位点将hly基因片段克隆到pMD19-T载体,构建得到重组质粒pWT-hly,并比较所克隆基因序列的同源性.然后将该基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pWET-hly,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE分析.结果表明:克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性为96.19%;重组菌株经IPTG诱导后,hly基因得到了高效表达.     

Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础.     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

冬鲽鱼抗冻蛋白基因的人工合成

合成适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白（Winter flounder antifreeze protein,Wf-AFP）基因.参照冬鲽鱼抗冻蛋白的氨基酸序列及棉花偏爱的密码子,重新设计适合在棉花中表达的Wf-AFP基因序列;根据此序列设计6条寡核苷酸引物,通过PCR方法将其拼接成完整的基因;克隆到pUCm-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,抽提重组子进行酶切鉴定及序列分析.结果表明合成的Wf-AFP基因序列与设计方案完全相符,通过PCR介导的基因合成方法成功获得了适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白基因.     

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.实验结果表明：该基因大小为1980bp,共编码659个氨基酸,在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;该酶的相对分子质量约为73000,由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成,其在不同温度和pH值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近.     

污水中红霉素抗性菌的特性

针对抗生素过度使用对生态环境和人类健康造成潜在威胁的问题，采用微生物的分离培养方法和PCR检测方法，对北方某污水处理厂中各个处理单元中红霉素残留浓度、抗性菌、抗性基因的特性进行了详实的研究。研究结果显示，在污水中检测到红霉素浓度22.8 ~ 86.9 μg·L-1，在去除率为55.4% ~ 66.3%。进水、出水中残留的红霉素抗性菌的浓度分别在6.9 ~ 8.4 × 105、 2.8 ~ 4.5 × 105 CFU·mL-1。单一红霉素抗性菌比例为45.0%，双重抗生素抗性菌株的比例40.84%，三重抗生素抗性菌株的比例14.16%。抗性菌对6种抗生素抗性也表现出不同的抗性。抗生素抗性基因中浓度在2.3 ~ 9.5 log (copies·L-1)。1株单一抗性菌未检测到ere A、ere B、mef A/mef E和erm B；三重抗性菌中，4 株未能检测到tet Q，3 株未能检测到Sul 2。研究结果表明污水中红霉素残留量高、红霉素抗性菌具有多重抗生素抗性，对抗性基因的演变产生具有重要影响，与抗性菌抗性存在相应的关系。     

限制性内切酶MluⅠ基因的合成、克隆和初步表达

在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表达载体PUC19上,重组表达载体构成PUC19-M.MluⅠ.测序结果显示,载体构建成功后利用体外重组转化技术,将pet30a-MluⅠ和PUC19-M.MluⅠ转入T7expression E.coli表达菌株中.重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现限制性内切酶MluⅠ成功表达.该酶的成功表达不仅为后续研究提供了材料,而且为实验室制备限制性内切酶在方法上开辟了新的途径,为更多新发现的内切酶基因的成功克隆提供了参考.     

枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.     

β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的克隆与表达

为研究重组β琼脂糖酶(AgaA7)基因的表达产物及其生物活性,根据GeneBank中β琼脂糖酶(AgaA7)基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体PQE30中,测序结果证明合成基因序列正确,未改变读码框.然后将此表达载体转入E.coli M15中进行诱导表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并鉴定其生物活性.结果表明:其相对分子质量约为5.0×104,与预期相符,具有生物活性.     

磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达载体的构建

根据genebank中公布的pmi基因序列通过PCR的方法从大肠杆菌中得到目的片断,并与pGM-T easy载体连接.将鉴定为阳性重组子中的目的基因进一步与植物表达载体pBI121的不同区域连接,成功构建了载体NPTII-pmi-121和pmi-121^△NPTII.     

四环素类和磺胺类双重抗生素抗性菌的特性

为了研究抗生素抗性菌、抗性基因的扩散和污染可能产生对环境和人类健康的威胁,分8 次采集城市污水处理厂（sewage treatment plants,STPs）水样,应用肉汤微量稀释法和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)方法,分离、鉴定对四环素、磺胺甲恶唑敏感菌株,分析其抗生素抗性,检测抗性基因．结果：本研究中,从某污水处理厂出水中分离22株四环素类抗性菌、26株磺胺类抗性菌,检测其对常用抗生素耐受性及抗生素浓度、抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)含量。四环素类和磺胺类双重抗性菌在5.04×102～2.51×103 CFU·mL-1（colony-forming unit,CFU）范围内,抗性菌对9 种抗生素具有抗性,最高耐受力为512mg·mL-1,其中,对氯霉素耐受能力最强,对青霉素、氨苄青霉素、头孢氨苄、环丙沙星、庆大霉素、阿奇霉素耐受力次之,对利福平耐受力最弱;检测到双重抗性基因,其中tet W和sul1的含量较高. 结果表明：城市污水处理厂的四环素类和磺胺类抗生素含量较高,存在双重抗性菌、抗性基因。     

基于染色体的重组工程系统的改进

重组工程是指通过重组酶催化DNA之间的同源重组,实现DNA克隆和修饰的一种基因工程技术.本研究从重组酶基因整合至大肠杆菌DH10B所获得的基于染色体的重组工程系统菌株LS-GR出发,利用菌株自身的重组工程系统和双链断裂修复功能,敲除了编码5’->3’单链DNA外切酶的recJ基因和编码3’->5’DNA外切核酸酶的sbcB基因,获得重组效率得以提高的菌株LS2002和LS2004.单链寡核苷酸修复和双链断裂修复实验表明所得菌株较LS-GR的重组效率有明显提高,对需要重组效率高的重组工程实验具有重要的应用价值.     

嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)R551-3四环素抗性消除的研究

嗜麦芽寡养单胞菌可共代谢降解烟碱类农药吡虫啉,并且对多种抗生素具有抗性.本文通过电穿孔法消除了该菌的四环素抗性,获得了四环素敏感型菌株R551-3Tcr-,可以用作遗传转化系统的受体菌,能被转化吸收遗传载体质粒pJB866H::ndhSL,构成一对很好的嗜麦芽寡养单胞菌遗传转化系统.同时HPLC结果表明所获得的四环素敏感型菌株羟基化吡虫啉的活性并未发生改变,为进一步开展敲除和回补共代谢途径关键酶的研究工作奠定了基础.     

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性.天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长.笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因（天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因）构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础.