Paenibacillus sp. K1 乳糖酶基因bga在乳酸乳球菌中的表达

为了提高乳酸乳球菌利用乳糖的能力,缓解乳糖不耐症,以实验室构建的含有乳糖酶基因的质粒pUC-bga为模板,通过PCR扩增得到乳糖酶基因bga,将其分别与载体pSEC和pMG36e连接,获得重组质粒pSEC-bga和pMG36e-bga,重组质粒分别电转Lactococcus lactis NZ9000和Lactococcus lactis MG1614,并在乳酸乳球菌细胞内实现了活性表达。高压液相色谱（HPLC）分析其对培养基中乳糖的利用能力,结果重组菌L.lactis NZ9000-Bga对乳糖的利用能力比对照菌株高一倍,为生产低乳糖的发酵乳制品奠定了基础。     

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达

为建立溶栓药物瑞替普酶(r PA)的乳酸菌表达系统,从实验室前期构建的大肠杆菌表达质粒p ET22b-rpa上扩增出目的基因rpa,将该基因与乳酸菌表达质粒pCYT连接,构建了pCYT-rpa质粒.此外,为提高r PA在乳酸乳球菌NZ9000中的稳定性,同时构建了rpa位于葡萄球菌(Staphylococcal)耐热核酸酶基因nuc下游融合表达的重组质粒pCYT-nuc-rpa.将质粒p CYT-rpa和p CYT-nuc-rpa分别电转化至乳酸乳球菌NZ9000中,经Nisin诱导表达,Western blot结果显示Nuc可提高r PA在乳酸乳球菌中的稳定性,从而增加了rPA在乳酸菌中的表达量.重组r PA及Nuc-rPA在复性后均具有溶栓活性,活性分别为800,U/L和1,000,U/L.     

玉米酒糟为主要氮源的Nisin生产菌株的诱变选育

为使乳酸乳球菌适应玉米酒糟作为发酵生产乳酸链球菌素(Nisin)的主要氮源,首先对培养基进行了初步优化,发现在酒糟清液中加入蔗糖、酵母膏和磷酸氢二钾明显促进了乳酸乳球菌的生长.在此基础上,使用等离子体对乳酸乳球菌进行诱变处理,利用24方孔深孔板技术可实现对高产Nisin突变菌株的选择性筛选.结果表明,诱变菌株在只有5.0%存活率时,得到的正突变菌株可达26.2%.借助摇瓶发酵实验对其生产Nisin的发酵水平进行研究,发现有1株诱变选育菌株发酵Nisin的活性高达6 520 U/mL,并且其发酵能力比诱变起始菌株能力更强.     

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

乳酸乳球菌电转化条件的研究

以质粒pTRKH2为材料,对乳酸乳球菌MG1614进行电转化条件的研究.实验结果表明,在电转化过程中,电场强度、电阻大小、细胞生长状态和电击后菌株复苏时间均对转化效率有明显影响,得到了乳酸乳球菌的最适电转化条件为:对数生长中期的细胞,经1%甘氨酸处理,在10kVcm电场强度、400Ω电阻下电转化,转化后细胞在SGM17培养液中培养2h后涂布选择性培养基,转化率(转化子个数与DNA质量之比)可达1.2×103个μg,比优化前的转化效率提高近100倍.     

产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌的等离子体诱变选育

采用产乳酸链球菌素(Nisin)的乳酸乳球菌为出发菌株,在含有高浓度Nisin的固体平板上,筛选出了耐受10 000IU/mL Nisin的乳酸乳球菌菌株,其发酵单位达到1 680IU/mL。以此菌株为起始菌株进行常压、室温等离子体诱变,利用24方孔深孔板快速筛选高产Nisin的突变株。结果表明,在诱变菌株的存活率为3%的条件下获得的突变株的正突变率达到27.3%。通过摇瓶发酵进一步考察初步筛选的正突变株的Nisin发酵水平,发现有一个突变株发酵Nisin的活性达到6 120IU/mL。     

利用双向电泳技术分离乳酸乳球菌N8菌体蛋白

乳酸乳球菌N8是工业上生产细菌素nisin的重要生产菌株.利用双向电泳技术对乳酸乳球菌N8的菌体蛋白质进行了有效地分离,分析双向电泳图谱获得584个蛋白质点.通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱分析以及蛋白数据库检索,成功鉴定出其中6种乳酸乳球菌蛋白,为后续乳酸乳球菌蛋白质组学研究奠定了基础.     

牦牛乳中乳链菌肽产生菌的定向筛选及抗菌活性研究

以新鲜牦牛乳为原料,采用选择培养基及抑菌圈法定向筛选、富集微生物,通过生理生化指标检测及16S rDNA鉴定乳链菌肽产生菌,并采用滤纸片扩散法检测其抗菌活性.结果表明,共筛选出4株乳链菌肽产生菌,4株菌均符合乳酸乳球菌生理生化特征,且其16S rDNA与乳酸乳球菌的测序结果完全一致,确认为乳酸乳球菌;这4株菌只对G~+菌产生抑菌圈,对G~-菌没有抑菌活性,其中菌株Lac4对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌都体现出强抑制作用,菌株Lac1对藤黄微球菌有强抑制作用,对金黄色葡萄球菌是弱抑制作用,而菌株Lac2和Lac3对藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌都是弱抑制作用.     

产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化

为构建1株产中性蛋白酶的工程菌株并对其发酵条件进行优化,以中性蛋白酶工业生产菌株枯草芽孢杆菌AS1.398的基因组为模板,采用PCR技术扩增获得中性蛋白酶基因npr,与高拷贝质粒pWB980连接并转入蛋白酶缺陷型菌株枯草芽孢杆菌WB600中得到重组工程菌WB600/pWB980-npr.在初筛平板上工程菌蛋白酶活力明显高于工业生产菌AS1.398,工程菌发酵活力可达1,398.3,U/mL.通过对其发酵工艺进一步优化,在接种量5%、装液量100,mL/500,mL、摇床转速180,r/min、温度34,℃的条件下发酵48,h,发酵液的酶活力可达2,487.5,U/mL,比优化前提高了78%.     

产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化

以非解朊栖热菌HG102基因文库筛选的重组质粒pUC18-atgly为模板PCR扩增α-葡萄糖苷酶结构基因,与表达载体pET28α(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.对重组菌的产酶条件进行了初步优化,最终酶活由4.25U/mL提高到40.85U/mL.     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

Pseudomonas koreensis JDM-2株ACC脱氨酶基因的克隆和表达

应用PCR从杜仲内生Pseudomonas koreensis JDM-2株基因组中扩增出ACC脱氨酶基因acdS,将其克隆到pMD18-T载体并段进行DNA测序,通过BamHⅠ和HindⅢ酶切从重组质粒pMD18ACDS中切下acdS基因序列,将其连接到pQE30质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点,构建表达质粒pQE30ACDS,转化大肠杆菌BL21,利用比色法测定ACC脱氨酶活力.测序结果表明,JDM-2菌株acdS基因大小为1 017 bp,与已报道不同菌种acdS基因的同源性在86％～99％之间.SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中表达了分子量为38 kDa的ACC脱氨酶.酶活性检测结果显示重组菌ACC脱氨酶的酶活力为0.214 U/mg.     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建

以米曲霉Aspergillus oryzae RIB40的基因组DNA为模板,PCR扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA. 将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子下,得到表达载体pNMA-RML,通过ApaI酶切线性化转化米曲霉宿主菌A.oryzae niaD300,得到整合型的阳性转化子A.oryzae ONL1. 其培养7天的培养液上清在以三丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈,碱滴定法酶活测定表明培养液酶活可达2.5 U/mL,培养液上清的SDS-PAGE图谱在32.5 kDa处有RML的特征条带. 以上结果表明RML已经在米曲霉中成功表达,同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的.     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础