表达异源木糖异构酶对谷氨酸棒杆菌利用木糖的影响

微生物细胞木糖代谢对生物质水解液全利用和促进特定重要化学品的合成具有重要意义.谷氨酸棒杆菌为重要的氨基酸工业生产菌株,由于缺乏木糖异构酶编码基因而不能代谢木糖.本研究通过质粒过表达不同来源的木糖异构酶基因xyl A,实现了菌株对木糖的利用,其中大肠杆菌木糖异构酶效果最好.由于木糖异构酶的活性是制约菌株代谢木糖的瓶颈因素,因此对启动子的SD序列进行了替换以促进翻译效率,使菌株在木糖培养基中生长的A600值达到出发菌的2.7倍.通过基因组整合3个拷贝的优化后xyl A表达模块,实现了无质粒的木糖代谢工程菌株的构建,为后续谷氨酸棒杆菌利用木糖生产高附加值化学品的代谢工程研究奠定基础.     

lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合.首先构建一个携带lys1-d和EGFP(enhanced green fluorescent protein)报告基因的整合载体,然后将载体转化至敲除了内源lys1基因的毕赤酵母中,最后分别检测了转化子内EGFP含量和质粒拷贝数.结果显示,所有转化子整合的质粒拷贝数均处于19～168之间;并且转化子内质粒拷贝数越高,其胞内表达的EGFP产量也越高.这一系统为构建毕赤酵母超高拷贝质粒整合菌株增添了有效的工具.     

酿酒酵母中的嗜热细菌木糖异构酶活性表达及木糖代谢研究

将来自嗜热放线细菌Thermobif ida f usca的木糖异构酶（xylose isomerase,XI）基因xylA,连接于酵母表达载体pYES2的半乳糖诱导启动子（PGAL）下,得到重组质粒pYES2-xylA,用其转化酵母菌INVSc1,测定重组酵母菌株INVSc1-xylA的木糖异构酶活性,并对重组酵母菌株进行木糖葡萄糖共发酵试验,探讨在酿酒酵母中建立新的生产乙醇木糖代射途径。结果木糖异构酶在75℃,pH值6.8的酶活力最高,在酿酒酵母中成功地获得活性表达,并且SDS-PAGE电泳有明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。INVSc1-xylA在木糖葡萄糖共发酵实验中消耗木糖和产生乙醇分别比对照菌提高53.8%和36%,提高了其生产乙醇的能力。     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建

利用PCR技术,以酿酒酵母S288c的基因组DNA为模板,扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合成酶基因(ScINO1)包含1 602bp的开放读码框,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定,测序结果与GenBank上已登录的ScINO1序列完全一致.对PUG6载体进行改造,构建了rDNA介导的多拷贝整合表达载体pURH,并将ScINO1基因连入载体pURH,获得ScINO1基因超表达载体pURIH.为下一步的微生物发酵法产肌醇和获得能够耐高乙醇的酵母工程菌株的研究奠定基础.     

P137G点突变对嗜热细菌木糖异构酶酶活性及热稳定性的影响

利用重叠延伸法对嗜热细菌（Thermus thermphilus）的木糖异构酶基因xylA进行体外P137G定点突变，通过酿酒酵母表达载体XM204将突变基因xylA137引入酿酒酵母H158中，得到重组菌株H158 XI137. 酶活分析表明，H158 XI137在中温条件下的酶活有很大的提高，与对照菌株H158 XI相比，30?℃时的酶活提高1倍，并且拓宽了最适反应pH，但是其热稳定性大大降低. 结果表明，嗜热细菌木糖异构酶137位的Pro对维持其热稳定性起到重要的作用，并且对其酶学性质有很大的影响.     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控

采用酵母杂合启动子PADH2－CUP1或PADH2－GAPDH及终止子TADH1，构建了一系列酵母表达载体．在这些表达载体中插入乙肝病毒表面抗原S－preS1融合基因SA－28后，将合乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒PHC11的BamHI位点．然后将表达质粒分别转化酿酒酵母Y16，Y19．对SA－28基因表达的研究表明，在酵母菌胞内实现了SA－28基因的高表达，且表达受葡萄糖浓度调控．     

重组真菌细胞色素P450nor2在酵母细胞中的表达

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种理想的真核蛋白表达系统．将真菌细胞色素P450nor2基因亚克隆到酵母表达载体pAUR123中，构建重组表达质粒pAUR-P450nor2并转化酿酒酵母AH22，经Aureobasidin A筛选和菌落PCR鉴定得到阳性克隆．SDS-PAGE分析证实：重组的真菌细胞色素P450nor2在酵母细胞中实现了高表达．     

短小芽孢杆菌C-9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C-9中克隆得到葡聚糖内切酶基因,该基因包含1980 bp核苷酸,编码559个氨基酸,其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列;以YIp5质粒为骨架,构建rDNA介导的多拷贝整合载体,实现葡聚糖内切酶在酿酒酵母中的高效、稳定表达。与对照菌株相比,含有葡聚糖内切酶基因的重组酿酒酵母可以在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基上生长。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子，人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因，将其克隆于M13载体中，DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因，将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-hFTH，电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带，与报道的hFTH的相对分子质量相近；酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

突变野油菜黄单胞菌α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的整合表达

用定向进化的一种新方法,对野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)的α-淀粉酶基因(XAMY)进行PCR体外诱变后获得了一个编码的酶活性提高的突变基因,将其克隆到由rDNA序列介导的酵母整合型表达载体pHBM368上,得到重组质粒pHBM368XA.将pHBM368XA转化酿酒酵母S.cerevisiae INVScⅠ,获得了整合型分泌表达α-淀粉酶的酵母重组菌株XA01.对选择的3个工程菌α-淀粉酶表达的稳定性进行了检测,结果表明在完全培养基中连续培养80代,淀粉酶的酶活性仍然保持稳定.在淀粉酶自身信号肽引导下,胞外分泌效率可达50%.     

两株产人参皂苷糖苷酶酵母菌株的18S rDNA和ITS序列分析

对两株产人参皂苷糖苷酶的酵母菌株进行核糖体18S rDNA和ITS序列克隆测定,获得了长度分别为1 477和1 478 bp的18S rDNA序列和长度分别为791和727 bp的ITS序列,对获得的基因序列进行比对及同源性分析,结果显示,两株酵母菌的18S rDNA序列的相似性达100%,而ITS序列的相似性则为66%,均与NCBI数据库中登录的啤酒酵母的相应序列同源性最高.从GenBank中选取部分不同种属的酵母菌ITS序列,以ITS为对象构建系统发育树,从分子生物学角度确定了两株酵母菌为酵母菌属的不同种类.     

可降解淀粉酿酒酵母基因工程菌的构建及其生产应用

将酿酒酵母的rDNA片段,黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因表达盒及G418抗性基因表达盒重组进经过改造的质粒pSP72,构建酿酒酵母整合型质粒YIp4RGAn及YIp19RGAn,转化酿酒酵母实验室菌株GRF18、生产菌株JL108、SD和JM,获得能高效表达葡萄糖淀粉酶和分解淀粉的酿酒酵母基因工菌。Southern印迹分析证明,葡萄糖淀粉酶基因已整合进工程菌染色体。这些工程菌在含有20%淀粉的培养基中培养,产酒率都在11%以上。     

人类超氧化物歧化酶在酿酒酵母系统中的高效表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种在生物界广泛存在的抗氧化酶,在抗衰老、抗肿瘤、抗免疫疾病和电磁辐射上都起着重要的作用．对一从人类胎肝cDNA文库中筛到的SOD基因片段进行重组、克隆,并得到带有启动子PADHZ—GAPDH和终止子TADHI的高效稳定的酿酒酵母表达载体pHC11-hSOD．转化酿酒酵母DCO4后获得工程菌DCO4／pHC11-hSOD．表达产物经破壁后SDS-PAGE电泳检测为20ku的条带;酶活性测定结果表明发酵液有40万U／L的hSOD活性．此外,还研究了工程菌的发酵条件和hSOD产物的纯化方法．纯化产物在SDS-PAGE上和Superdex分子筛检测显示,所得产物的纯度已达95％以上．     

植酸酶分泌型酵母工程菌的构建

通过逆转录PCR从无花果曲霉总RNA中扩增出1.4-kb带信号肽的植酸酶基因，将其克隆到穿梭表示载体pYES2，构建了含有目的的基因的重组质粒pYPA1.用pYPA1转化酿酒酵母INVSc1菌株，成功地构建了能分泌活性植酸酶的工程菌株。该菌株的成功构建为饲料和食品添加剂以及解磷工程菌肥的开发奠定了基础。     

染色体位置对酵母SUC2基因表达的影响

通过ＦＬＰ－ＦＲＴ位点特异性ＤＮＡ切离和ＤＮＡ定点整合技术,将酵母蔗糖酶基因整合到酿酒酵母染色体不同位置上,测定了ＳＵＣ２基因表达情况,从而对酵母染色体位置效应进行了初步研究。     

甘肃张掖地区葡萄天然酵母菌的筛选及其系统发育分析

目的：通过对张掖地区酵母菌的筛选,了解张掖地区酵母菌的生物多样性。方法：采用YPD培养基分离纯化菌株,通过26SrDNA基因D1／D2区序列分析确定菌种的系统进化地位。结果：分离筛选出6个属天然酵母菌。分别为：假丝酵母属Candida、Meyerozyma属、红酵母属Rhodotorula、孢汉逊属Hanseniaspora、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae和毕赤酵母属Pichia,共10个种,其中包括6个疑似种。     

High-frequency transformation of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, has been used extensively for genetic studies but until now it has not been utilized as a host organism for DNA cloning. Here we describe a method for high-frequency transformation fo a leu 1(-) strain of this yeast with hybrid plasmids containing the Saccharomyces cerevisiae LEu 2(+) gene, a bacterial plasmid and either the S. cerevisiae 2 μm plasmid or autonomously replicating sequences (ars)(1) derived from S. pombe DNA. Some of the plasmids contain unique restriction sites which make them suitable for the isolation of S. pombe genes, and they can also be used for the exchange of DNA between S. pombe and S. cerevisiae.