人源锌指蛋白ZNF24及其锌指结构域的表达、纯化及DNA结合性质的研究

转录因子是调控基因表达的关键蛋白，能够以序列特异性方式结合DNA。ZNF24是Krüppel-like锌指转录因子家族成员之一，在细胞增殖和分化中起重要作用，能促进肝癌细胞的增殖，抑制神经元细胞的分化。ZNF24蛋白N端包含一个SCAN结构域，C端为锌指区，由4个串联的C2H2型锌指结构组成。ZNF24能特异性识别和结合基因的启动子，参与基因的表达调控，但其发挥功能的具体分子机制并不清楚。本文我们在大肠杆菌中成功表达了人源锌指蛋白ZNF24全长和其锌指结构域ZNF24(243～368),ZNF24全长蛋白在溶液中以三聚体形式存在，而锌指结构域在溶液中为单体，表明ZNF24蛋白N端的SCAN结构域能够促进全长蛋白的寡聚化。凝胶迁移实验验证ZNF24全长蛋白和锌指结构域与双链DNA底物结合能力，为进一步研究锌指蛋白ZNF24调控基因表达提供理论基础，相关结果表明SCAN结构域介导的蛋白寡聚可能代表了一种新的转录活性调节机制。     

大鼠小脑特异基因Zic的克隆、序列分析和初步表达

EST（AW055732）片段是SD大鼠脑内一特异表达基因cDNA的3‘-端片段,与小鼠和人的Zic基因同源。基于小鼠及人的Zic基因的同源序列,设计引物用PCR方法从SD大鼠中克隆得到该基因的编码区序列（rZic)。该基因编码一锌指蛋白,其锌指结构域与线虫的tra-1基因,果蝇的ci^D基因。人的Gli癌基因和果蝇的opa基因的锌指结构域高度同源,用RT－PCR方法分析了rZic基因在大鼠脑区分布状况。结果表明,rZic基因在小脑中高表达。将该rZic基因克隆至带有6个组氨酸的表达载体pET-32a( )中,用IPTG诱导rZic融合蛋白在大肠杆菌BL21菌株中表达,诱导后重组蛋白质占菌体总蛋白的20．8％。     

一个新C2H2型锌指蛋白的功能的初步研究

通过筛选人18周胎脑cDNA文库,得到一条编码332AA的全长新基因,生物信息学研究表明,该蛋白质序列有2个C2H2型锌指结构,其中1个锌指结构有RNA－binding蛋白特异锌指的特征,虽然同源比较发现与多种蛋白质精氨酸N端转甲基酶（protein arginine N-methyltransferase) 有一定的同源性,但新锌指蛋白不含转甲基酶的活性功能区域,属功能未知的基因,利用芯片研究功能未知基因的表达是一种较好的手段,通过代谢增强剂PMA（phorbol myristae acetate)刺激培养的血管内皮细胞,观察细胞受激活后新锌指蛋白基因的表达变化,结果表明新基因表达量提高了11倍以上,证实新基因属内皮细胞的极早期应答基因（Immediate early response gene,ERG)。     

水稻C2H2型锌指蛋白OsZAT12转化拟南芥功能的初步研究

摘要:植物C2H2型锌指蛋白是植物转录调节因子中的大家族,通过转录调控、翻译后调节和蛋白质间的相互作用在植物发育和环境胁迫中发挥关键作用. 本研究在水稻基因组中克隆到一个C2H2型锌指蛋白,命名为OsZAT12. 生物信息学分析显示OsZAT12全长597bp,其中不包含内含子,其蛋白质序列含有199个氨基酸,具有两个典型的C2H2锌指结构. OsZAT12蛋白定位于细胞核,在根中特异性表达.过表达拟南芥植株与野生型比较,其根变短,子叶的变绿率明显降低,植株矮小.初步推断OsZAT12可能影响植物生长发育尤其是根的伸长.     

位点特异性DNA内切酶在植物基因打靶中的应用

基因打靶是在基因组指定位点插入、删除和替换DNA序列的技术。由于同源重组频率低,在植物中高效的基因打靶技术一直未被建立,制约了植物基因功能和分子育种的研究。近年来,人工设计的锌指蛋白和TAL效应因子DNA结合结构域实现了对全新DNA序列的识别。人工设计的DNA结合结构域连接核酸内切酶能在基因组指定位点创造双链DNA断裂,进而产生定点突变和促进同源重组。笔者重点介绍锌指核酸酶和TAL效应因子核酸酶在植物基因组定点突变和基因打靶中的研究进展,并对目前存在的问题进行分析。     

锌指结构基因ZNF302序列的克隆与表达谱分析

从人脑脑cDNA文库中克隆到1条1685nt的锌指蛋白新基因cDNAycb gq ,命名为ZNF302,生物信息学分析表明,ZNF302的C末端含有13个保守的C2H2锌指结构;Northern-blot结果提示这一基因可能存在3．0kb和4.2kb的2种转录本。Unigene软件包分析,该基因定位于19号染色体19q13.2-13.3;cDNA基因芯片检测显示疤痕成纤维细胞经TGFβ1刺激和ECV304细胞经PMA,LPS刺激后,ZNF302基因表达明显升高,提示其与细胞增殖的正调控有关。     

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy, HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现，有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统，为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统，本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒，筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子，筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后，我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region, LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)的AAV6递送载体系统，感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya, T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除，流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-...     

筛选EV71 3C蛋白酶切割的宿主细胞蛋白

肠道病毒EV71 型是引起儿童手足口病的主要病原体,3C 是其编码的蛋白酶之一.3C 在切割病毒前体蛋白为成熟蛋白的同时,切割一些具有重要功能的细胞蛋白,影响细胞的生理功能. 为进一步了解EV71 与宿主的关系,明确EV71 致病机制的细节,在前期以3C 蛋白为诱饵开展的酵母双杂交工作的基础上,选取了5 种细胞蛋白,分析其是否是3C 蛋白可能的切割底物. 发现ZMYM2 蛋白可以被3C 切割;这一切割效应是依赖3C 蛋白酶活性的特异性切割,无需RNA 介导. 上述发现为进一步揭示EV71 致病机制提供了线索.     

人类RING型锌指蛋白DTX2的全长cDNA克隆与序列分析

鉴定了一个人类WWE与RING型锌指基因DTX2,位于人染色体7q11.23. 通过RACE获得的全长cDNA显示，DTX2编码包含两个WWE区域与一个RING锌指区域的蛋白.     

肠激酶消化融合蛋白Trx-Exendin-4的特性

选用Invitrogen公司开发的重组肠激酶,在不同反应条件下消化融合蛋白Trx-Exendin-4,用16%的Tricine-SDS-PAGE检测目的多肽Exendin-4与其他切割产物的量.结果表明:温度对肠激酶消化融合蛋白Trx-Exendin-4的影响很大,37℃时酶活力高,以非特异性切割为主;16℃时酶活力居中,特异性切割与非特异性切割共存;4℃时酶活力较低,但以特异性切割为主.获得Exendin-4的最佳消化条件是:1 U肠激酶在4℃条件下6 h消化3 mg的Trx-Exendin-4,效率最高,特异性最好.     

同源模建法建立和检验人类新基因ZNF191锌指基序的三维构象

以实验室自行克隆的新基因ＺＮＦ１９１顺序为材料，按三联体密友转换出锌指基因编码的４个锌指结构域ＮＦ１９１ａ，ｂ，ｃ和ｄ的蛋白质一级顺序，并将它们与已用晶体衍射法确证了空间构象的７个Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（Ｃ２Ｈ２）型锌指进行同源比较，从中发现锌指７ＺＮＦ和１ＺＮＦ的一级结构与待检验的锌指顺序同源高且间隙较小。     

Progress of gene targeting in mouse

Gene targeting is a powerful approach of studying the gene function in vivo. Specific genetic modifications, including simple gene disruption, point mutations, large chromosomal deletions and rearrangements, targeted incorporation of foreign genes, could be introduced into the mouse genome by gene targeting. Recent studies make it possible to do the gene targeting with temporal and spatial control.     

四种原发恶性肿瘤中p16基因的缺失和突变研究

采用双重PCR、PCR－SSCP和序列分析方法,对31例非小细胞肺癌、15例食管癌、12例胃癌、9例乳腺癌共68例原发肿瘤组织标p16进行在肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌的缺失率分别为16％（5／31）、,20－％（3／15）,8％（1／13）,0（0／9）,2例突变：一例食管癌在第130位氨基酸密码由AGA变为ATA,编码的氨基酸由精氨酸变为异亮氨酸,一例肺癌第140位氨基酸的CGG处的C缺失,导致移码突变,p16基因在人类恶性肿瘤发生发展中起重要作用,是多肿瘤抑制基因。     

GCK2软件在p53基因克隆过程中的应用

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，通过克隆p53基因对其表达调控进行研究。利用 分子生物学软件GCK2.0对整个克隆过程进行分析，制定克隆策略，通过测序鉴定结果，得到了含目的基因 p53cDNA全序列的pTRE-p53重组质粒,通过GCK2.0分析,减少了基因克隆的盲目性,提高了工作效率。     

一种新型基因枪的研究

为研制一种适应各种场合 ,尤其是在野外操作的基因枪 ,满足将目的基因导入动植物细胞 ,使之稳定表达并遗传 ,实现培育或改良新的优良品种。以压缩弹簧为动力 ,运用撞击发射原理 ,对裹着基因的微粒进行加速 ,使之获得足够的动能 ,去射击靶细胞。弹簧预压力不同 ,微弹的动能随之不同 ,可适应不同细胞的要求。利用所设计的装置 ,在常压下将GUS基因导入番茄叶片细胞 ,经检测 ,得到表达 ;将质粒psv- luc2 0转入小鼠的皮肤、腹部肌肉和肝脏内 ,也得到表达。实验表明 ,该构思是可行的 ,实验装置可以在常压下操作 ,能在各种条件下使用     

GCK2软件在p53基因克隆过程中的应用

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的押癌基因，通过克隆p53基因对其表达调控进行研究。利用分子生物学软件GCK2．0对整个克隆过程进行分析，制定克隆策略，通过测序鉴定结果，得到了舍目的基因p53cDNA全序列的pTRE—p53重组质粒。通过GCK2．0分析，减少了基因克隆的盲目性，提高了工作效率。     

柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。