大麦黄矮病毒抗性基因的Ti质粒构建

通过酶切、连接、转化等技术,将大麦黄矮病毒抗性基因制酶基因ＯＲＦ２插入Ｔｉ质粒ｐＧＡ４８２的Ｔ－ＤＮＡ区,从而提供了新的目的基因转化小麦的农杆菌／质粒系统。     

外源基因在球形芽孢杆菌中的转化

为了扩大芽孢杆菌属的受体系统范围，对球形芽孢杆菌进行了质粒消除，并用含有溶葡球菌酶基因的质粒ｐＥ１９４ｃｏｐ６－１转化，结果表明，该酶基因在球形芽孢杆菌中获得了稳定，高效表达。     

天冬氨酸酶基因工程菌质粒pXZ70的稳定性

将pSC101质粒上的Par区域（控制质粒分配的基因座）克隆到含有天冬氨酸酶基因的质粒pXZ70上，构建成重组质粒pZZ1，将pZZ1质粒转化入大肠杆菌JM109细胞中，得到一株质粒可稳定遗传的重组子细胞，培养100代后，含质粒菌数仍在90％以上．     

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因在荧光假单胞菌中的表达

将已克隆到的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans)C-2的几丁酶基因chi1片段克隆到质粒载体pUXBF5中，得到重组质粒pUXCH1，该重组质粒在大肠杆菌中可以表达产生具有生物活性的几丁酶并分泌到胞外。将pUXCH1分别利用感受态法和三亲本杂交法转化荧光假单胞菌（Psendomonas fluorescens），在含有卡拉霉素的金氏B平板上筛得转化子。但将转化子点种于几丁质平板上却不能产生水解圈，提取细胞内容物后用比色法也没有检测到有效的酶活性。该研究表明环状芽孢杆菌 的几个酶基因chi1已经被成功的整合到荧光假单胞菌的染色体上，但却没有表达或表达效率极低，这可能是由于荧光假单胞菌的表达系统不能正确有效的识别存在于该chi1几丁酶基因片段中的环状芽孢杆菌基因启动子而造成的。     

穿梭质粒pNBC11的构建及性质研究

质粒 pUB110与 pUC18分别册 EcoRI 酶切,T_4DNA 连接酶进行连接,得到重组质粒 pBC11。琼脂糖凝胶电泳分析,该质粒分子量为4.8×10~6道尔顿。pBC11是一种穿梭质粒,能转化大肠杆菌和枯草杆菌,它对大肠杆菌 C600、JM101的转化率分别为:4×10~5、1.5×10~5转化体/μgDNA.对枯草杆菌 BR151、QB1130的转化率分别为1.5×10~3、2.15×10~3转化体/μgDNA。在基因表达方面,pBC11上的 K_m~r 基因能在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达,但 pBC11的 Ap~r 基因不能在枯草杆菌中表达。     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv - 2E3和ScFV - 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET - 2 0b ,pET - 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒PUC -2E3和pUC - 1A8,pET2 0b - 2E3和pET2 0b - 1A8,pET2 8a - 2E3和pET2 8a - 1A8以及pHOG - 2E3和pHOG - 1A8,然后分别转化至大肠杆菌中 ,提取质粒 ,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析 ,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段 ,说明已成功构建了 8个含ScFv基因的表达质粒     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将2种抗A型产气英膜梭菌α毒素单链抗体（ScFv）基因ScFv－2E3和ScFV-1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET-20b,pET-28a和pHOG21中,构建了重组质粒PUC2E3和pUC-1A8,pET20b-2E3和pET20b-1A9,pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和pHOG-1A8,然后分别转化至大肠杆菌中,提取质粒,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段,说明已成功构建了8个含ScFv基因的表达质粒。     

基因工程中重组质粒的获得

用两种特异的限制性核酸内切酶同时酶切含目的基因的DNA片段与质粒,可以有效的降低或防止目的基因和质粒表达载体在酶切后的末端发生任意连接;双抗生素间接平板筛选,得到含有目的基因的质粒。     

大麦黄矮病毒（BYDV）外壳蛋白基因在小麦原生质体中的稳定转化

实验采用ＰＥＧ介导法转化小麦，用ＧＵＳ基因作为标志，用荧光法测定Ａｃｔｌ－ＧＵＳ、Ｅｍｕ－ＧＵＳ、３５Ｓ－ＧＵＳ三种质粒转化小麦细胞后的瞬间表达强度，以比较Ａｃｔｌ、Ｅｍｕ、３５Ｓ三种启动子在小表中的表达强度．结果表明，Ａｃｔｌ和Ｅｍｕ的强度大致相等，均比３５Ｓ强．采用Ｅｍｕ为启动子带ＢＹＤＶＣＰ基因的质粒和经改造过的Ａｃｔ１为启动子带有抗潮霉素选择标记基因的质粒共转化小麦“济南１７７”的原生质体．转化６ｄ后，用潮霉素进行筛选，最后得到两块抗潮霉素的愈伤组织，转化后４个月，经ＰＣＲ检测，证明ＣＰ基因已整合进一块愈伤组织的细胞基因组中．     

BYDV CP基因转化小麦原生质体及转基因植株再生

用原生质体融合技术与ＰＥＧ介导的直接转基因方法相结合，使高频率分裂的小麦济南１７７悬浮细胞系原生质体与具有分化能力的小麦济南１７７胚性意伤组织原生质体融合，形成具有分裂和分化能力的融合细胞；同时，利用ＰＥＧ对原生质体的直接转基因作用，将带有抗病毒基因（ＢＹＤＶＣＹｇｅｎｅ）的质粒Ｐｐｐ１５与带有抗性选择标记基因的质粒严ＰＢｌＡｃｔＳＮ导入融合细胞中．经抗性筛选获得抗潮霉素（Ｈｍ）的阳性克隆并再生植株．对再生植株作ＰＣＲ检测表明，ＣＰ基因已整合到转化植株的基因组中并稳定表达．     

水稻基因整合平台系统供体质粒pURKMT的构建

提高水稻产量,改良稻米品质是育种学家广泛研究的课题．随着现代生物技术的发展,水稻已成为植物基因工程的重要研究对象．许多实验室已成功地建立了一系列供外源基因转化水稻的系统．但是这些转化系统主要应用Ｔｉ质粒衍生的载体,通过Ｔ－ＤＮＡ左右两端的序列将目的基...     

生菜遗传转化受体系统的建立及鲑鱼降钙素基因的导入

以散叶生菜大速生(Lactuca sativa var.capatata L.)为试材，以MS为基本培养基。采用不同激素配比，确定生菜高效诱芽培养基为MS 0．1 mg／L6-BA 0．05mg／LNAA；抗生素敏感性试验表明，筛选培养基中适宜的卡那霉素选择压为75mg／L，抑菌剂羧苄青霉素的适宜质量浓度为300mg／L；通过根癌农杆菌介导的叶盘法将鲑鱼降钙素(sCT)基因转入大速生散叶生菜，PCR检测转化率达25．4％。     

Efficient transformation and expression of gfp gene in the edible mushroom Pleurotus nebrodensis

An efficient transformation method mediated by PEG-protoplasts was developed for the newly commercial edible mushroom Pleu-rotus nebrodensis. Two plasmids were used to co-transform protoplasts of P. nebrodensis. One plasmid is pAN7-1 containing a positive selectable marker gene hph conferring hygromycin B resistance. Another plasmid is pBIue-GFP containing a reporter gene gfp conferring green fluorescent protein. PCR and Southern blot analysis showed that hph gene or/and gfp gene were integrated into the genome of P.nebrodensis transformants. The transformation efficiency of the positive selectable marker gene hph was 3 transformants per microgram of plasmid pAN7-1 DNA, which was about 30 times higher than that previously reported in thoroughly studied Pleurotus species such as Pleurotus ostreatus. The transformation efficiency of the reporter gene gfp was 9 transformants per microgram of plasmid pBlu-GFP DNA. The co-transformation efficiency was 23.68%. This is the first report that a "reporter" gene, green fluorescent protein gene can be successfully stably expressed in this Pleurotus species.     

Gene transfer to plants by diverse species of bacteria

Agrobacterium is widely considered to be the only bacterial genus capable of transferring genes to plants. When suitably modified, Agrobacterium has become the most effective vector for gene transfer in plant biotechnology. However, the complexity of the patent landscape has created both real and perceived obstacles to the effective use of this technology for agricultural improvements by many public and private organizations worldwide. Here we show that several species of bacteria outside the Agrobacterium genus can be modified to mediate gene transfer to a number of diverse plants. These plant-associated symbiotic bacteria were made competent for gene transfer by acquisition of both a disarmed Ti plasmid and a suitable binary vector. This alternative to Agrobacterium-mediated technology for crop improvement, in addition to affording a versatile 'open source' platform for plant biotechnology, may lead to new uses of natural bacteria-plant interactions to achieve plant transformation.     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因的克隆及序列分析

根据U．Washington报导的根癌土壤农杆菌(Agribacterium tumefaciens)C58Ti质粒基因序列，设计1对引物，利用PCR的方法扩增了c58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因。通过琼脂糖凝胶电泳，所得E1的片段略小于500bp，与引物设计跨幅片段476bp相吻合。将此片段连接到T载体，经蓝白斑筛选、PCR鉴定、测序及DNA序列分析，结果表明：克隆VirD1基因编码序列与报导的序列同源性达100％，说明通过PCR方法获得的VirD1基因片段是正确的，为进一步研究该基因的表达和活性奠定了基础。     

Light-inducible and chloroplast-associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vector

A chimaeric gene, consisting of the 5'-flanking region of a member of the Pisum sativum gene family encoding ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase linked to the coding region of a bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene, has been introduced into the genome of the plant Nicotiana tabacum using a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. The expression of the chimaeric gene is light-inducible in chloroplast-containing transformed tissue.     

甜菜夜蛾核型多角体病毒vp39基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

利用DNA重组技术，将杆状病毒极早期基因iel启动子基因克隆至重组质粒pGEM-Se39中，成功地构建了重组真核表达质粒pGEM-IE1-Se39。