甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri fad2基因片段克隆及hpRNA植物表达载体的构建

首先利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和Lesquerella fendleri基因组DNA中分别扩增出Δ12-脂肪酸去饱和酶fad2基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出相应的小片段,然后将同一基因的大小片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的napin启动子和nos终止子之间,构建成可以在种子中转录表达发夹RNA(Hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体.     

角化细胞生长因子的获得及植物表达载体的构建

从鼠肺中提取RNA,设计相应的引物,经RT PCR扩增出角化细胞生长因子cDNA序列;插入pMD18 T载体,经DNA测序证实为KGF基因.将KGF基因经酶切后连接于植物CaMV35S启动子和NOS终止子之间,单酶切插入pBI1301植物双元表达载体,转化大肠杆菌,阳性克隆提取质粒后转化农杆菌EHA105,实现KGF植物表达载体的构建,为KGF的进一步研究奠定基础.     

甘蓝型油菜FAE1基因启动子的克隆和瞬时表达载体的构建及功能分析

油菜脂肪酸延长酶基因FAE1是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,根据GenBank上已知的植物FAE1基因启动子序列设计引物,以从甘蓝型油菜(Braccica napus.L)叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1 328 bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列在NCBI进行blast比对,同源性为99.78%,说明该片段与植物中已知的FAE1基因的启动子序列有极高的相似性.将该片段替换掉改造后的pBI221上面的35S启动子从而构建了原生质体瞬时表达载体.然后通过PEG介导的方式将含有FAE1启动子驱动的荧光素酶报告基因(LUC)表达载体导入油菜原生质体中,研究报告基因表达量,证明出脱落酸(ABA)影响了报告基因的表达,随着ABA浓度的不断增加,LUC的表达量呈现逐步下降的趋势.     

中国番茄黄化曲叶病毒双向启动子的鉴定

以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物感染的烟草植物总DNA为模板,扩增病毒双向启动子片段,并分别以不同方向与gus基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.用土壤杆菌介导的方法将质粒载体导入本氏烟叶片细胞和植株茎部进行瞬时表达结果表明,互补链和病毒链启动子均能驱动gus基因表达,并且互补链启动子的活性高于病毒链启动子的活性.TYLCCNV伴随的卫星DNAβ分子的βC1的表达载体与启动子载体进行瞬时共表达时,βC1对病毒链和互补链启动子的活性均没有调节作用.     

蝴蝶兰ACC氧化酶cDNA片段的克隆及其反义植物表达载体的构建

根据已报道的蝴蝶兰ACC氧化酶的基因序列,设计了一对引物,通过RT—PCR从蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC氧化酶的cDNA片段,将其连接到pMD19-T载体上进行测序．结果显示,该片段与参考的已报道序列具有99．70％的同源性．测序后将该基因的cDNA序列反向插入pBI221的CaMV35S启动子和nos terminator之间,构建了蝴蝶兰ACC氧化酶的反义基因植物表达载体,为进一步转化蝴蝶兰研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础．     

甘草水通道蛋白PIP1基因正义和反义表达载体的构建

根据已报道的GuPIP1基因序列设计特异引物,克隆甘草水通道蛋白GuPIP1基因cDNA序列,将该片段正向、反向分别插入植物表达载体pMBW330的CaMV35S启动子和OCS终止子之间,构建了正义、反义表达载体．通过双酶切、PER和DNA测序鉴定后,分别导入农杆菌EHA105中．     

马尾松银松素合酶基因转化双子叶植物表达载体的构建及鉴定

以马尾松为材料,在获得马尾松银松素合酶基因的基础上,构建了该基因转化双子叶植物的表达载体,该表达载体含有35S启动子和NOS终止子,能启动基因在双子叶植物中高效地表达.设计并合成分别含有Bgl和BstE酶切位点的上下游引物,通过PCR反应扩增出含有该酶切位点的银松素合酶基因cDNA全序列,酶切后连接到pCAMBIA1301植物表达载体上.经PCR鉴定、酶切分析及DNA测序证实cDNA片段大小、序列以及读码框的正确性.最后通过电击将表达载体转化农杆菌LBA4404,为进一步研究银松素合酶基因的功能奠定基础.     

番茄红素β-环化酶基因（LcyB）启动子调控LcyB RNAi双元载体构建

根据番茄基因组DNA序列信息设计引物进行PCR扩增了Micro-Tom中番茄红素-环化酶（Lycopene -cyclase, LcyB）基因起始密码子上游1 534 bp启动子区域序列（LcyBp）,生物信息学分析表明,该启动子序列中存在TATA-盒、CAAT-盒、昼夜节律响应元件Circadian、光响应元件Box I、真菌激发子响应元件Box-W1、低温响应元件LTR、响应赤霉素的作用元件P-box、乙烯响应元件ERE、响应生长素的作用元件TGA-element等顺式作用元件. 依据番茄LcyB基因序列,设计2对含有不同酶切位点的特异引物进行PCR扩增LcyB基因3端特异的276 bp DNA片段,利用RNAi载体pKANNIBAL构建了LcyB启动子-LcyB基因正义片段（Sense）-PDK内含子-LcyB基因反义片段（Antisense）-OCS终止子的RNAi表达框,并将这一RNAi表达框插入植物双元表达载体pART27的Not I位点,构建成本研究的LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB. 为利用RNAi技术特异性敲除LcyB基因进而提高番茄果实中番茄红素含量奠定实验基础.     

Id3启动子/荧光素酶基因载体的构建及其在WEHI-231细胞中的活性表达

用PCR法从WEHI-231细胞基因组DNA扩增小鼠Id3(mId3)基因5’端含启动子序列的不同长度的DNA片段(mId3-pf)亚克隆至荧光素酶(Luc)报道基因载体PGV-B2,构建由mId3基因启动子片段控制的Luc报道基因重组载体mId3-pf/PGV-B2.用电穿孔术将mId3-pf/PGV-B2导入培养的WEHI-231细胞,用抗小鼠IgM抗体刺激转染后的WEHI-231细胞,24 h后测定胞内Luc活性.结果表明,4种Luc报道基因重组载体转染细胞均表现较高的mId3启动子活性,与空载体转染细胞相比,启动子活性分别升高25~60倍.抗IgM抗体刺激细胞后,Id3启动子活性较未刺激细胞均呈明显增高趋势,增高幅度可达2倍左右.表明抗IgM抗体诱导WEHI-231细胞Id3的上调表达与Id3转录活性的升高有关.     

Klenow大片段聚合酶及T4DNA聚合酶在构建重组质粒中的应用

利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5＇→3＇聚合酶活性和T4DNA聚合酶3＇→5＇外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST.用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植物表达载体pBLG-VP4-ST中的HindⅢ3＇凹端补平,再利用T4DNA聚合酶外切酶活性将质粒pUC18-435S的四倍35S启动子即T35S中的SacⅠ3＇凸端削平.在T4DNA连接酶作用下将一端为平端,另一端为BamHⅠ的粘性末端的四倍35S启动子定向连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中取代原有的双35S启动子,转化并筛选阳性克隆.结果经PCR和酶切鉴定证实,四倍35S启动子成功连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中.     

拟南芥翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位研究

探讨了拟南芥的翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位.以Col野生型拟南芥的cDNA为模板,通过高保真KOD扩增酶获得2 363bp的拟南芥转录延伸因子EF1A基因片段,将其与GFP融合后共同连入p1300表达载体,利用农杆菌侵染法将p35S∶GFP和p35S∶EF1A∶∶GFP转入野生型拟南芥中,观察转基因植物细胞中GFP的表达情况.结果显示:p35S∶GFP转基因植物中,细胞核中GFP荧光强度显著高于细胞质中荧光强度,但是在p35S∶EF1A∶∶GFP转基因植物中,细胞核中荧光强度与细胞质中荧光强度无显著差异,说明在进行蛋白翻译时细胞质中的EF1A含量显著高于细胞核中,这也为翻译延伸因子EF1A的亚细胞定位提供了实验依据.     

牛酪蛋白基因导入大豆的研究

将带有牛酪蛋白基因caseinB的植物表达载体 pAS -2 ,在大豆自花授粉后 ,用注射法导入大豆受精子房中 .以质粒 pAS -2的 3 5S -Casein -Gus片段为模板 ,随机引物法标记探针 ,对 1 0 3株受体植株后代的DNA进行点杂交和Southern杂交 ,发现其中 1株在点杂交和Southern杂交中均呈阳性 .证明外源基因已整合到大豆基因组中 .     

新疆小拟南芥ApCBF1基因的克隆及其过量表达转基因的研究

利用同源克隆法,克隆了小拟南芥的CBF1基因的cDNA（FJ491244）,比对分析结果表明,ApCBF1的cDNA序列的A252,在拟南芥的AtCBF1的cDNA是T252,但翻译的氨基酸均是Ala,表明ApCBF1和AtCBF1翻译的氨基酸序列完全一致。构建了过量表达载体：p35S：ApCBF1,通过花滴法转入小拟南芥中。RT-PCR检测结果表明,转基因T0代AtCBF1基因过量表达。     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

水稻苯达松敏感致死基因的RAPD标记的克隆及测序

用3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit试剂盒将与水稻苯达松敏感致死基因相连锁的RAPD遗传标记S20—420和S316—600回收纯化，连接于pGEM—T载体并克隆测序，得到了S20—420和S316—600的全序列，其长度分别为423bp、606bp．将两端序列设计特异PCR扩增引物可用于检测水稻苯达松敏感致死基因和标记辅助育种．     

35S启动子组入蓝藻质粒载体pUC13－pbl

３５Ｓ启动子组入蓝藻质粒载体ｐＵＣ１３－ｐｂｌ楼士林，郭奕斌，吴巧娟（生物学系）近年来构建了一些含３５Ｓ启动子的质粒载体￣［１］，但未见含３５Ｓ启动子的蓝藻质粒载体．因此本研究拟把ＣａＭＶ的３５Ｓ启动子组入由孙立春等人构建的蓝藻质粒载体ｐＵＣ１３－ｐ...     

红色糖多孢菌红霉素抗性基因的克隆与鉴定

将红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）的染色体DNA用PsTi酶切后与载体PUWL201连接，转化变沿青链霉菌（S.lividans)TK23的原生质体。采用双重抗性筛选得到了9个转化子。分别抽提其中的质粒并再次转化原生质体，在含红霉素的平板上各筛选约200个转化子，其中3个在抗性板上生长良好，分别命名为PLP42、PLP1b和PLP44。对其中的PLP42酶切分析表明，其含有约3.0Kb的红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）染色体DNA片段，它的载体部分发生了缺失。以PUC18为载体，将PLP42的1.7kb-KpnI片断克隆、测序、经与Genebank的ermE基因顺序比较，证实巳克隆了Saccharopolyspora erythraea的抗性基因。     

Cre-lox重组系统介导转基因烟草中外源基因删除的研究

对Cre在转基因个体中介导的重组效率进行了研究。构建了含有Cre 基因(p35S-Cre)和 GUS 基因侧翼含同向loxP 位点的(loxP-p35S-GUS-loxP)两种植物表达载体。以共转化的技术将两种基因元件同时转化烟草得到转基因植株,根据对共转化植株GUS 基因的活性分析、分子检测、PCR检测及对重组后扩增DNA片段进行序列分析表明：Cre-loxP 重组系统在转基因烟草中能精确高效地介导转基因的删除,但也存在部分植株不能完全删除的现象。