拟南芥PSAL基因启动子的克隆和瞬时表达载体的构建及功能分析

将含有PSA-L启动子驱动的荧光素酶报告基因(LUC)表达载体导入拟南芥原生质体中,研究报告基因表达量,证明出脱落酸(ABA)影响了报告基因的表达.在有ABA存在的时候,启动子驱动作用减弱.     

FAE1启动子的克隆和转γ-TMT基因大豆的获得

脂肪酸链延长酶组分1(FAE1)是广泛存在于植物中催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶,该反应是脂肪酸碳链延长的限速步骤,在油料种子胚中特异性表达.以拟南芥基因组DNA为模板,设计引物,扩增到该基因的启动子片段.序列分析表明,该片段长度为943 bp,与GenBank注册序列AF355982达99.5%同源,并含有与之完全相同的种子特异性表达元件,据此认定它具有种子特异性启动活性.将其与甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因连接,构建成表达载体pFAE1-TMT,通过农杆菌介导的方法转化大豆胚尖,获得28株卡那霉素抗性筛选植株,进一步PCR检测获得2株转γ-TMT基因植株.     

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

Fibrillin操纵子在甘蓝型油菜和拟南芥中的瞬时表达

将Fibrillin操纵子驱动的荧光素酶报告基因表达载体导入拟南芥原生质体中,研究基因表达调控,证明脱落酸(ABA)诱导报告基因的表达.同时将相同的质粒转化到甘蓝型油菜蜀杂9号原生质体中,获得与拟南芥中类似的表达结果.实验结果说明Fibrillin操纵子在拟南芥和油菜原生质体中均对ABA的诱导敏感.     

甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri fad2基因片段克隆及hpRNA植物表达载体的构建

首先利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和Lesquerella fendleri基因组DNA中分别扩增出Δ12-脂肪酸去饱和酶fad2基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出相应的小片段,然后将同一基因的大小片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的napin启动子和nos终止子之间,构建成可以在种子中转录表达发夹RNA(Hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体.     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

sⅡ系列缺失启动子载体的构建

为检测新型sII根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sII基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段.在启动子片段的5'和3'端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sII基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体.该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sII不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能.     

玉米MAR序列的分离及其在转基因烟草中的功能研究

从玉米基因组中分离了一段核基质结合区(MAR)序列,它位于乙醇脱氢酶1基因的5'端启动子区域.为研究此段MAR序列在转基因植物中的功能,将MAR构建在报告基因β-葡糖醛酸酶(GUS)基因(uidA)和植物选择标记新霉素磷酸转移酶II基因(nptII)的两侧形成植物表达载体,在载体中两段MAR之间的距离为6.2kb.GUS活性检测表明,MAR序列对报告基因的表达水平没有影响.这一现象与MAR只构建在报告基因两侧形成小环时提高外源基因表达的结果不同,为进一步研究MAR作用机制提供了基础.     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

农杆菌介导外源基因进入油菜的研究

用甘蓝型油菜子叶为外植体，以农杆菌共培养法将苏云金杆菌δ－内毒素基因和ＮＰＴＩ基因导入油菜．所用的农杆菌为ＬＢＡ４４０４－δ（ｄｉｓａｒｍｅｄｐＡＬ４４０４，ｐＧＡ６４３－δ）．ＰＧＡ６４３－δ为表达载体，其中克隆有ＮＰＴＩ基因和δ－内毒素基因．共培养４ｄ后，转化的子叶被转入含有卡那霉素（Ｋｍ）的分化培养基［１］上，分化出芽．被切下的芽在含有Ｋｍ的生根培养基［２］上生根，移栽后成活的小抗Ｋｍ油菜苗生长良好．用ＤＮＡ分子杂交、ＥＬＩＳＡ分析和生物测定等方法证明外源基因被转移到油菜中．     

蝴蝶兰ACC氧化酶cDNA片段的克隆及其反义植物表达载体的构建

根据已报道的蝴蝶兰ACC氧化酶的基因序列,设计了一对引物,通过RT—PCR从蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC氧化酶的cDNA片段,将其连接到pMD19-T载体上进行测序．结果显示,该片段与参考的已报道序列具有99．70％的同源性．测序后将该基因的cDNA序列反向插入pBI221的CaMV35S启动子和nos terminator之间,构建了蝴蝶兰ACC氧化酶的反义基因植物表达载体,为进一步转化蝴蝶兰研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础．     

Construction of plant seed-specific expression vectors pSCB and pSCAB and the obtainment of transgenic Brassica napus H165 expressing poly-3-hydroxybutyrate synthetic genes

The seed-specific promoter and transit peptide were amplified and fused to the three genes phbA, phbB and phbC encoding PHB synthetic enzymes, respectively. Seed-specific expression vectors pSCB containing phbC and phbB, and pSCAB containing phbC, phbB and phbA, were constructed by introducing the genes with promoter and peptide into the binary vector pBI101. Transgenic Brassica napus H165 were obtained by Agrobacterium-mediated transformation with these vectors. They were confirmed by PCR, Southern and RT-PCR analyses.     

甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器，大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码，在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白，转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白，它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用，构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比，Toc33基因的表达调控研究较少，该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此，在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上，采用单引物PCR方法进行染色体步移，克隆出Toc33基因的启动子，为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．     

甘蓝型油菜植物防御素基因的克隆与原核表达

根据Genbank上已知的植物防御素基因设计引物，以甘蓝型油菜中的品种”蜀杂九号”种子总RNA反转录成的eDNA为模板，进行PCR扩增，获得了243bp的片段．将该片段回收。连接到pMD18-T载体测序，将测序片段经酶切回收后克隆到GTK表达载体中，在0．1mmol IPTG诱导下表达出与理论值相符的34kD的融合蛋白条带，用GST单克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测，获得阳性结果，这为甘蓝型油菜植物防御素基因功能的进一步研究提供了基础．     

花特异表达启动子的克隆及花色调节基因Lc表达载体的构建

克隆了矮牵牛花特异表达基因CHSA启动子，并定向插入到已含有花色调节基因Lc的质粒pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子．所构建的新表达载体可用于花色改良研究．     

毛白杨4CL基因启动子的克隆及初步功能分析

4CL(4-coumarate:CoA ligase,4-香豆酸:辅酶A连接酶)在植物木质素合成途径中催化羟基香豆酸生成羟基肉桂酰CoA,主要在木质部中表达,对植物木质素生物合成具重要调控作用.为研究4CL基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程研究中的潜在应用价值,利用PCR方法从毛白杨基因组DNA中扩增得到了4CL启动子片段.序列分析表明与美洲山杨(P.tremuloids)的4CL启动子同源性为95%.采用生物信息学方法对该序列进行分析.与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的瞬时表达检测可见明显GUS活性.     

Cloning the Promoter of BcNA1 from Brassica napus and Fad2 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of the Plant Expression Vector

The upstream regulatory region of a seed-specific gene was isolated from the genomic DNA of Brassica napus by PCR amplification. The cloned fragment contained 1755 nucleotides, and shared a sequence homology of 99.6% with the reported data. The coding region of oleic acid desaturase gene was then cloned from Arabidopsis thaliana. The sequencing analysis indicated that the sequence of the PCR product was just the same as reported before. In addition, the plant expression vector harboring the seed-specific promoter and trans-Fad2 gene was constructed.     

Cloning the Promoter of BcNA1 from Brassica napus and Fad2 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of the Plant Expression Vector

The upstream regulatory region of a seed-specific gene was isolated from the genomic DNA of Brassica napus by PCR amplification. The cloned fragment contained 1755 nucleotides, and shared a sequence homology of 99.6% with the reported data. The coding region of oleic acid desaturase gene was then cloned from Arabidopsis thaliana. The sequencing analysis indicated that the sequence of the PCR product was just the same as reported before. In addition, the plant expression vector harboring the seed-specific promoter and trans-Fad2 gene was constructed.     

脱水蛋白DHN1表达载体pBV221-dhn1的构建及基因表达

以克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )为基础 ,构建脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.采用PCR技术从克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )上扩增dhn1片段 ,并引入NcoⅠ /BamHⅠ酶切位点 ,然后与 pBV2 2 1原核表达载体连接 ,得到 pBV2 2 1 dhn1表达载体 .阳性克隆经PCR和NcoⅠ /BamHⅠ酶切检测都得到 516bp的dhn1片段 ,且序列正确 .表达载体pBV2 2 1 dhn1转化宿主菌后能够表达产生相对分子质量为 2 2× 10 3的DHN1,该蛋白具有高温可溶性 .以上结果表明 ,本实验得到了高效表达的脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.