温泉菌宏基因组文库的构建

为克隆温泉菌中耐热的新型木聚糖酶基因,通过提取未培养即墨温泉样品的基因组DNA,剪切并末端平头化后,用pUC18质粒为载体连接转化大肠杆菌,构建了一个包括1.2×105左右克隆的宏基因组文库.文库中外源DNA总容量约为3.0×105kb,文库中插入所需大小片段的成功率达87%.     

胡萝卜extensin信号肽引导的HB-S2.S基因表达载体构建

为了提高乙肝病毒表面抗原HB-S2.S基因在胡萝卜中的表达强度、表达稳定性,进一步提高其免疫原性.实验人工合成一段胡萝卜extensin信号肽序列,并将其与HB-S2.S基因融合,然后将该融合基因组入含有MAR序列的pBITM2MARⅡ中,取代原有的GUS基因,建立表达载体(TM2-HB1HB3),同时建立单纯表达HB-S2.S基因的对照载体(pBI-HB2HB3)和含有MAR序列的单纯表达HB-S2.S基因的对照载体(TM2-HB2HB3).该系列载体将被转入胡萝卜,以研究信号肽及MAR序列对外源基因表达优化效率的影响.     

sⅡ系列缺失启动子载体的构建

为检测新型sII根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sII基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段.在启动子片段的5'和3'端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sII基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体.该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sII不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能.