II型猪圆环病毒ORF2基因的原核表达与初步应用

II型猪圆环病毒(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORF2为模板,扩增截短的ORF2(tORF2)基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-tORF2并转化大肠杆菌BL21(DE3).经SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的tORF2,重组蛋白分子量约为45ku,表达量约为菌体总蛋白的20%,重组蛋白具有良好的免疫学活性.用tORF2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)阳性猪血清进行Western blot检测,有4份(20%)血清显示PCV2抗体阳性,说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象.本研究初步证明表达的tORF2重组融合蛋白可以应用于临床检测.     

青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

为表达青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR),构建了TSHR基因的原核表达载体pGEX-4T-1-TSHR,并将其转化入大肠杆菌DH5α中.采用IPTG诱导蛋白表达,并用SDS-PAGE分析表达蛋白.利用抗TSHR多克隆抗体进行Western blot检测.结果表明重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达,融合蛋白的分子大小约为76kDa,Western blot检测说明得到的融合蛋白为TSHR蛋白,成功构建了文昌鱼TSHR基因的原核表达载体.     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

花生AhAO2基因融合表达、纯化与抗体制备

研究构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2的实验结果显示,重组pPROEX-Hta-AhAO2表达质粒在E.coli BL21中高表达His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,Western blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

嗜水气单胞菌外膜蛋白omp TS基因的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物，运用聚合酶链式反应(PCR)扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamH I和EcoR I位点，构建重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTC诱导获得高效表达，SDS—PAGE蛋白电泳表明在39．9kD处出现超强特异带，占总蛋白的51％。以Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该39．9kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示，该抗体与表达的融合蛋白和嗜水气单胞菌中提取的36．9kD外膜蛋白均呈阳性反应，表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性，从而为此融合蛋白作为疫苗的候选成份提供理论依据。     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3，构建了Ag85B—ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下，重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815（H-2^4）细胞。通过G418压力筛选后，得到1株阳性克隆细胞。经过RT-PCR检测到该细胞中有Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达，用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光，证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。     

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体，PCR合成ompT引导序列，插入该载体多克隆位点上游，构建了分泌型原核表达载体pTO-OT．将2个外源基因克隆至pTO-OT，2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达．表达产量在25％～34％之间．Western blot分析证实了融合蛋白可被大肠杆菌信号肽酶有效地切割。并具有良好的免疫学活性．对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的表达稳定性，显示了其在基因工程中的应用价值．     

猪呼吸道冠状病毒核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

以RT—PCR法从猪呼吸道冠状病毒(PRCV)感染的ST细胞中得到核衣壳蛋白(N蛋白)cDNA,并以此为模板利用PCR技术完成了N蛋白的基因扩增．通过双酶切、连接、转化等过程构建了猪PRCVN蛋白基因的重组原核表达质粒,表达产物经SDS—PAGE、Western blot检测被确认为GST融合的N蛋白．表达蛋白与PRCV阳性血清间有良好的免疫结合性．     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体融合蛋白的构建及表达

用RT-PCR方法从人胎肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因,并用酶切连接方法将其与抗人AFP嵌合抗体拼接,连接到质粒pVITRO上,构建真核表达载体.将重组质粒转染CHO细胞,以RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测融合蛋白的表达.结果显示稳定转染细胞株有约150kDa的融合蛋白表达.     

融合蛋白TAT-p53-MTS的促细胞凋亡作用

本研究首先构建了融合蛋白 TAT-p53-MTS 的原核表达质粒 pET-22b(+)-TAT-p53-MTS,将表达纯化的融合蛋白与p53缺陷型人肺癌细胞NCI-H1299孵育,通过Western blot和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测融合蛋白的细胞穿膜以及与 Bcl-2蛋白的相互作用,并通过流式细胞术检测融合蛋白对 NCI-H1299细胞的促凋亡作用。结果显示,融合TAT和MTS的p53重组蛋白具有更强的细胞穿膜及线粒体定位能力;并且,融合蛋白能够通过与Bcl-2蛋白的结合显著诱导NCI-H 1299细胞的凋亡。     

结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗的构建及表达

构建结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗,并对其在体外真核细胞中进行表达。用EcoRV和Hindm双酶切合HSP65-IL-2融合基因的pPaO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断HSP65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（-）中,重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体瞬时转染COS-7细胞,并通过间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。重组真核表达质粒酶切后可获得约2067bp的融合基因HSP65-IL-2片段,间接免疫荧光检测重组质粒转染的COS-7细胞,可在细胞胞浆中看到特异性的绿色荧光。成功地构建了结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

幽门螺杆菌粘附素基因的原核表达

目的：构建幽门螺杆菌粘附素（hpaA）基因的原核表达载体，并诱导表达。方法：用PCR扩增hpaA目的基因片段，克隆至pQE-30表达载体中，构建含目的基因的表达质粒pQE-hpaA，转化E．coli DH5α，经IPTG诱导表达蛋白HpaA；Western blot分析其免疫反应性。结果：经测序hpaA基因片段由783bp组成，可编码260氨基酸残基的多肽。经SDS—PAGE分析相对分子量（Mr）约为30000。可溶性表达占全菌的42％以上。Western blot分析能与Hp全菌抗血清反应。结论：成功构建了粘附素hpaA基因的原核表达载体并能高效表达，为研制Hp疫苗提供理论依据。     

人EC-SOD的克隆及高效表达

将编码人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）成熟肽的cDNA插入含T7启动子的质粒pET-28a( )中构建表达质粒pET-EC-SOD，表达菌株用1mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达3h-5h后，产生较多的重组人EC-SOD，并形成包含体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白质的26%以上。经纯化和复性后的EC-SOD比活为每毫克纯化酶蛋白1200U。将EC-SOD转染粉纹夜蛾Tn-5Bl-4细胞，经扩增后在细胞内进行表达。SOS-PAGE分析结果表明，粉纹夜蛾细胞中表达一相对分子质量约为28ku的特异蛋白质带，Western blot分析表明，该特异条带即为EC-SOD蛋白，连苯三酚自氧化法测得表达产物比活为每毫克细胞裂解物260U。     

细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体融合蛋白的构建及表达

用RT-PCR方法从人胎肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因,并用酶切连接方法将其与抗人AFP嵌合抗体拼接,连接到质粒pVITRO上,构建真核表达载体。将重组质粒转染CHO细胞,以RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测融合蛋白的表达。结果显示稳定转染细胞株有约150kDa的融合蛋白表达。     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。     

鸭茅斑驳病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

通过RT-PCR技术从鸭茅斑驳病毒(CfMV)总RNA中获得了外被蛋白(CP)基因,并将其连接到含有编码GST基因的表达载体pGEX-4T-1后,得到重组质粒pGEXCfMV-JANCP,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys后,用IPTG诱导其基因表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后证明:CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子质量约为56．0 ku．     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

绵羊细粒棘球蚴Ag B基因的克隆、表达及其重组蛋白纯化

为克隆、表达绵羊细粒棘球蚴Eg Ag B基因,并纯化重组蛋白,采用PCR方法从绵羊肝脏包囊病料中扩增Ag B基因,克隆入p MD18-T载体中,测序后进行序列分析。将Ag B基因亚克隆入原核表达质粒p ET-28a中,转化入E.coli BL21感受态细胞中,用IPTG诱导Ag B蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:克隆的Ag B基因全长333 bp,通过SDS-PAGE可以检测到分子量为20 ku的特异性重组蛋白,与预期值相符;Western blot分析结果显示,该蛋白可与Eg阳性血清发生免疫学反应。本研究在大肠杆菌中成功表达的绵羊细粒棘球蚴Ag B蛋白,并证实其具有良好的反应原性,为绵羊细粒棘球蚴感染检测试剂的研发奠定了基础。